杜仲葉樹脂分離純化產物的抗疲勞功效

劉 迪，尚 華，宋曉宇

(1.陜西工業(yè)職業(yè)技術學院化工與紡織學院，陜西 咸陽 721000；2.陜西海升果業(yè)發(fā)展股份有限公司乾縣分公司，陜西 西安 713300)

杜仲(Eucommia ulmoides)，為杜仲科杜仲屬，在我國有著悠久的藥用歷史，具有降血壓[1-3]、調節(jié)血糖[4-5]、保護肝臟[6]、強筋骨[7]等功效。杜仲作為中藥材的使用部位主要是杜仲皮，然而現(xiàn)代研究表明，杜仲葉與杜仲皮的成分含量相近[8-9]，甚至某些成分含量較杜仲皮高[10]。楊春霞等[11]的研究表明，杜仲葉具有抗疲勞功效，但另一方面目前所見的相關報道大多是以杜仲葉粗提物為研究對象，較少見對純化產物分析研究的相關報道，導致抗疲勞功效成分尚不十分明確。本研究采用大孔吸附樹脂分離純化杜仲葉粗提物，并測定得到2種分離純化產物中多酚物質的質量分數(shù)，分別評價它們的抗疲勞功效，分析多酚與各產物抗疲勞功效的相關性，以探索杜仲葉抗疲勞作用機理。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

杜仲葉，由陜西略陽杜仲人工繁育基地提供。

XDA-8型大孔吸附樹脂 西安藍曉科技有限公司；沒食子酸標準品 中國藥品生物制品檢定所；福林-酚試劑(Folin-Ciocalteu) 美國Sigma公司；全血乳酸(LA)測試盒、血尿素氮(SUN)測試盒、肌糖原及肝糖原檢測試劑盒、乳酸脫氫酶(LDH)測定試劑盒 南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設備

FW-400A粉碎機 北京科偉儀器有限公司；DK-98-1電熱恒溫水浴鍋 天津泰斯特儀器有限公司；721可見分光光度計 上海精密科學儀器有限公司；HL-2恒流泵 上海亞榮有限公司。

1.3 實驗動物

清潔級雄性昆明種小鼠，體質量(20±2)g，由西安交通大學醫(yī)學實驗動物中心提供。

1.4 方法

1.4.1 杜仲葉粗提物的制備

杜仲葉洗凈，用烘箱于50℃烘干，粉碎成粉，過60目篩。將提取溶劑按照1：10的料液比與杜仲葉粉混合，50℃恒溫水浴鍋中浸提1h，浸提3次，過濾，合并濾液，離心分離，上清液為杜仲葉粗提溶液。

1.4.2 樹脂分離

采用XDA-8型大孔吸附樹脂對杜仲葉粗提物進行分離。樹脂經過預處理后按照規(guī)定的方法裝柱，將1BV體積的杜仲葉粗提液以1BV/h的流速流過樹脂柱，然后依次用4BV左右的20%、40%、60%和80%乙醇溶液以1BV/h的流速進行梯度洗脫。收集各洗脫溶液，減壓濃縮至干，真空冷凍干燥成粉。

1.4.3 多酚含量測定

以沒食子酸為標準品，用Folin-Ciocalteu[12]法對4種洗脫液干燥后的固體純化產物中多酚進行檢測，計算各樣品中的多酚含量。選取多酚含量最高的固體純化產物為EU1Ⅰ，多酚含量最低的固體純化產物為EU1Ⅱ，作為后實驗的研究對象。

1.4.4 動物實驗方法

小鼠被隨機分為對照組、EU1Ⅰ組和EU1Ⅱ組，每組40只，分籠飼養(yǎng)。小鼠在SPF動物房中飼養(yǎng)，溫度為(23±1)℃，相對濕度為40%～60%，小鼠先在SPF動物房適應3d。用純水將EU1Ⅰ和EU1Ⅱ溶解成0.2g/mL的水溶液。每組小鼠每天用灌胃針灌胃1次，對照組灌胃純水，EU1Ⅰ組灌胃EU1Ⅰ，EU1Ⅱ組灌胃EU1Ⅱ，按0.1mL/10g(以體質量計)連續(xù)灌胃15d。小鼠每天定時進行20～30min的游泳訓練，在灌胃飼養(yǎng)期間自由飲水和進食。

1.4.5 抗疲勞評價

1.4.5.1 體質量測定

灌胃飼養(yǎng)前和末次灌胃后，分別稱量各組小鼠的體質量。

1.4.5.2 負重游泳實驗

末次灌胃1h后，分別從對照組、EU1Ⅰ組和EU1Ⅱ組取10只小鼠，然后在距小鼠尾尖1cm處負5%體質量的橡皮泥，橡皮泥用保鮮膜包裹。將小鼠置于水深30cm、水溫(25.0±1.0)℃的水箱中，記錄小鼠自游泳開始至沉入箱底10s[11]不能浮上水面的時間為小鼠負重游泳時間。

1.4.5.3 LA測定實驗[11]

末次灌胃1h后，分別從對照組、EU1Ⅰ組和EU1Ⅱ組取10只小鼠，然后在距小鼠尾尖1cm處負5%體質量的橡皮泥，橡皮泥用保鮮膜包裹。將小鼠置于水深30cm、水溫(25.0±1.0)℃的水箱中游泳30min，然后立即取出摘眼球取血，血液被肝素抗凝后用分光光度法按照LA測試盒說明測定LA含量。

1.4.5.4 SUN、LDH[13]和糖原的測定[14]

末次灌胃1h后，分別從對照組、EU1Ⅰ組和EU1Ⅱ組取10只小鼠，將小鼠置于水深30cm、水溫(25.0±1.0)℃的水箱中游泳90min[11,14]，然后立即取出摘眼球取血，將血液在4000r/min條件下離心10min后取血清，用分光光度法按照SUN測試盒和LDH測試盒說明測定SUN含量和LDH活力。取血后的小鼠被處死，解剖后取肝臟和大腿處肌肉，用分光光度法按照肝糖原及肌糖原測試盒說明測定肝糖原和肌糖原含量。

1.4.6 統(tǒng)計分析方法

實驗數(shù)據(jù)用±s表示，t檢驗法檢驗，P＜0.05為顯著性差異，P＜0.01為極顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 多酚含量測定結果

經測定，20%、40%、60%和80%乙醇洗脫液干燥以后的固體純化產物中多酚含量分別為49.07、34.38、12.24、12.36g/100g。20%乙醇洗脫液固體純化產物中多酚含量最高，60%乙醇洗脫液固體純化產物中多酚含量最低，所以選擇前者為EU1Ⅰ、后者為EU1Ⅱ；60%和80%乙醇洗脫液固體純化產物中多酚含量相當。測定結果顯示，固體純化產物中多酚含量總的變化趨勢為隨著乙醇體積分數(shù)的降低而升高，表明杜仲葉多酚物質極性較大，適宜用極性較大的溶液分離純化。

2.2 抗疲勞功效結果

2.2.1 小鼠體質量

圖 1 EU1Ⅰ和EU1Ⅱ對小鼠體質量的影響Fig.1 Effect of EU1Ⅰ and EU1Ⅱ on body weights of mice

如圖1所示，灌胃飼養(yǎng)前和灌胃飼養(yǎng)后，各組小鼠的平均體質量相差范圍在0.83～1.70g，3組間無明顯差異，說明EU1Ⅰ和EU1Ⅱ對小鼠體質量無顯著影響(P＞0.05)。

2.2.2 小鼠游泳時間

如圖2所示，對照組小鼠平均負重游泳為47.01min，EU1Ⅰ組和EU1Ⅱ組小鼠平均負重游泳時間分別為62.52、59.26min，比對照組分別延長了52.23%、44.29%，且差異顯著(P＜0.01)，表明EU1Ⅰ和EU1Ⅱ均可以顯著地延長小鼠負重游泳時間，即二者可以顯著地提高小鼠運動耐受力，表現(xiàn)了較強的抗疲勞能力。

圖 2 EU1Ⅰ和EU1Ⅱ對小鼠負重游泳時間的影響Fig.2 Effect of EU1Ⅰ and EU1Ⅱ on weight-loaded swimming time of mice

2.2.3 小鼠血LA 含量

圖 3 EU1Ⅰ和EU1Ⅱ對小鼠血LA含量的影響Fig.3 Effect of EU1Ⅰ and EU1Ⅱ on blood LA in mice

如圖3所示，對照組小鼠平均血LA含量為4.65mmol/L，EU1Ⅰ組和EU1Ⅱ組小鼠平均血LA含量分別為2.21mmol/L和2.82mmol/L，比對照組分別降低了52.5%、39.4%，且差異極顯著(P＜0.01)，EU1Ⅰ對小鼠LA含量的降低幅度要高于EU1Ⅱ。

血液中的LA在機體處于無氧條件下劇烈運動會大量產生，引起體內pH值降低，如果這時LA不能被及時地從體內清除，大量聚集的LA會導致機體平衡失調，從而引起疲勞。因此，防止LA的大量生成，或者加速LA的清除，均可起到減緩疲勞的作用，EU1Ⅰ和EU1Ⅱ正是通過降低血LA含量表現(xiàn)其具有抗疲勞的能力。

2.2.4 小鼠SUN含量

圖 4 EU1Ⅰ和EU1Ⅱ對小鼠SUN含量的影響Fig.4 Effect of EU1Ⅰ and EU1Ⅱ on SUN in mice

如圖4所示，對照組小鼠平均SUN含量為13.20mmol/L，EU1Ⅰ組小鼠平均SUN含量為11.26mmol/L，比對照組降低了14.7%，且差異顯著(P＜0.05)，表明EU1Ⅰ可以顯著地減少SUN含量；EU1Ⅱ組小鼠平均SUN含量為13.03mmol/L，比對照組只降低了1.28%，且無明顯差異，表明EU1Ⅱ不能顯著地減少SUN含量。

機體內的能源物質是機體運動時產生能量的來源，糖原和蛋白質就屬于這些能源物質。糖原在機體運動之初會首先被消耗，當糖原消耗殆盡后蛋白質就會隨之被代謝分解。蛋白質被消耗的產物就是SUN，因此SUN含量的高低可以表明體內蛋白質被消耗的情況。如果機體具有很好的運動負荷適應能力，那么機體內的SUN含量就會比較低。實驗結果表明，只有EU1Ⅰ可以顯著地降低SUN含量，表明EU1Ⅰ可以顯著地提高機體對運動負荷的適應性。

2.2.5 小鼠肝糖原和肌糖原含量

圖 6 EU1Ⅰ和EU1Ⅱ對小鼠肌糖原含量的影響Fig.6 Effect of EU1Ⅰ and EU1Ⅱ on hepatic glycogen in mice

如圖5、6所示，對照組小鼠平均肝糖原含量為35.46mg/g，EU1Ⅰ組和EU1Ⅱ組小鼠平均肝糖原含量分別為57.72、49.67mg/g，比對照組分別提高了62.77%、40.07%，且差異顯著(P＜0.01)，表明EU1Ⅰ和EU1Ⅱ可以非常顯著地增加小鼠肝糖原含量；對照組小鼠平均肌糖原含量為3.57mg/g，EU1Ⅰ組和EU1Ⅱ組小鼠平均肌糖原含量分別為5.07、4.77mg/g，3組間無明顯差異(P＞0.05)，說明EU1Ⅰ和EU1Ⅱ并沒有顯著地影響肌糖原含量。

機體內的糖原分為肝糖原和肌糖原，肌糖原在運動中會首先被大量消耗，當肌糖原被消耗盡后，為了滿足能量的需求，肝糖原就會開始被消耗，如果機體繼續(xù)運動，肝糖原的儲存量就會不斷地減少，這時疲勞就會產生。EU1Ⅰ和EU1Ⅱ可以顯著地增加肝糖原的含量，從而延緩疲勞的產生。然而，二者對肌糖原含量的影響并不顯著，說明二者通過增加肌糖原含量延緩疲勞的作用有限。

2.2.6 小鼠LDH活力

圖 7 EU1Ⅰ和EU1Ⅱ對小鼠LDH活力的影響Fig.7 Effects of EU1Ⅰ and EU1Ⅱ on LDH activity in mice

EU1I和EU1Ⅱ對小鼠LDH活力的影響見圖7。對照組小鼠平均LDH活力為10853.45U/L，EU1I組小鼠平均LDH活力為11247.75U/L，比對照組提高了3.64%，且差異顯著(P＜0.05)，表明EU1Ⅰ可以顯著地增強LDH活力；EU1Ⅱ組小鼠平均LDH活力為9844.33U/L，EU1Ⅱ組小鼠的LDH活力低于對照組，說明EU1Ⅱ沒有增強LDH活力的功能。

LA可以通過LDH的作用而被氧化，從而使LA得到清除，使體內pH值恢復正常，減緩疲勞的產生。EU1Ⅰ提高了LDH活力，表明EU1Ⅰ可以通過提高LDH活力降低血LA含量，表現(xiàn)抗疲勞功效。2.2.3節(jié)中結果顯示，EU1Ⅱ也可以顯著降低血LA含量，但是本部分實驗結果顯示EU1Ⅱ并不能提高LDH活力，即在EU1Ⅱ組中血LA并不是通過LDH活力提高被降低，可能是通過其他途徑或被EU1Ⅱ中其他成分降低。

綜合以上各項指標的測定結果，EU1Ⅰ具有更為明顯地延長小鼠負重游泳時間、降低LA含量、降低SUN含量、提高肝糖原含量、增強LDH活力的能力，即具有明顯的抗疲勞功效。多酚含量實驗結果表明，EU1Ⅰ中多酚含量要高于EU1Ⅱ，而EU1Ⅰ的抗疲勞功效也較EU1Ⅱ顯著，表明杜仲葉樹脂分離純化產物的抗疲勞功效與多酚含量有關，推測多酚物質可能為杜仲葉純化產物表現(xiàn)抗疲勞功效的主要功效成分，但尚不清楚是否還與杜仲葉的其他成分有關，還有待于今后的進一步研究，如進一步分離純化EU1Ⅰ，以得到純度更高、成分更明確的杜仲葉純化產物，確定杜仲葉抗疲勞功效成分等。

3 結 論

杜仲葉經過大孔吸附樹脂分離純化，得到20%乙醇洗脫溶液(EU1Ⅰ)和60%乙醇洗脫溶液(EU1Ⅱ)，EU1Ⅰ中多酚含量高于EU1Ⅱ。

杜仲葉樹脂分離純化產物表現(xiàn)了一定的抗疲勞功效，并且EU1Ⅰ的抗疲勞功效強于EU1Ⅱ。杜仲葉樹脂分離純化產物的抗疲勞功效與多酚含量有關，推測多酚物質可能為純化產物表現(xiàn)抗疲勞功效的主要功效成分。

[1] GU Juan, WANG Junjie, YAN Jin, et al. Effects of lignans extracted from Eucommia ulmoides and aldose reductase inhibitor epalrestat on hypertensive vascular remodeling[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2011, 133(1)： 6-13.

[2] KWAN C Y, CHEN Changxun, DEYAMA T, et al. Endotheliumdependent vasorelaxant effects of the aqueous extracts of the Eucommia ulmoides Oliv. leaf and bark： implications on their antihypertensive action[J]. Vascular Pharmacology, 2003, 40(5)： 229-235.

[3] LUO Lifang, WU Weihua, ZHOU Yingjun, et al. Antihypertensive effect of Eucommia ulmoides Oliv. extracts in spontaneously hypertensive rats[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2010, 129(2)： 238-243.

[4] KIM H Y, MOON B H, LEE H J, et al. Flavonol glycosides from the leaves of Eucommia ulmoides O. with glycation inhibitory activity[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2004, 93： 227-230.

[5] LEE M K, KIM M J, CHO S Y, et al. Hypoglycemic effect of Duzhong (Eucommia ulmoides Oliv.) leaves in streptozotocin-induced diabetic rats[J]. Diabetes Research and Clinical Practice, 2005, 67(1)： 22-28.

[6] HUNG M Y, FU T Y C, SHIH P H, et al. Du-Zhong (Eucommia ulmoides Oliv.) leaves inhibits CCl4-induced hepatic damage in rats original research article[J] . Food and Chemical Toxicology, 2006, 44(8)： 1424-1431.

[7] ZHANG R, LIU Z. G, LI C, et al. Du-Zhong (Eucommia ulmoides Oliv.) cortex extract prevent OVX-induced osteoporosis in rats[J]. Bone, 2009, 45： 553-559.

[8] 管淑玉, 蘇薇薇. 杜仲化學成分與藥理研究進展[J]. 中藥材, 2003, 26(2)： 124-129.

[9] 辛曉明, 馮蕾, 王浩, 等. 杜仲的化學成分及藥理活力研究進展[J]. 醫(yī)學綜述, 2007, 13(19)： 1507-1509.

[10] 羅秀陽, 田呈瑞. 杜仲葉保健作用及其在食品加工中的應用[J]. 晉東南師范?？茖W校學報, 2003, 20(5)： 36-37.

[11] 楊春霞, 翟文俊. 杜仲葉提取物抗疲勞作用研究[J]. 食品科學, 2008, 29(9)： 550-552.

[12] 劉麗香, LAURA T L, 梁興飛, 等. Folin-Ciocalteu比色法測定苦丁茶中多酚含量[J]. 茶葉科學, 2008, 28(2)： 101-106.

[13] DING Jinfeng, LI Yanyan, XU Jiajie, et al. Study on effect of jellyfish collagen hydrolysate on anti-fatigue and anti-oxidation[J]. Food Hydrocolloids, 2011, 25(5)： 1350-1353.

[14] 高珊, 童英, 吳少平, 等. 昆明種小鼠抗疲勞試驗中若干參考值測定[J]. 實驗動物科學與管理, 2001, 18(1)： 16-18.