小麥肽對大鼠氮代謝以及胃腸黏膜結構和功能的影響

潘興昌，印 虹，谷瑞增，徐亞光，蔡木易，孫桂菊

(1.中國食品發酵工業研究院，北京 100028；2.東南大學公共衛生學院，江蘇 南京 210009)

食物中的蛋白質在機體的胃腸道內消化，釋放出了很多肽類物質。這些肽類物質不僅是生命活動中氨基酸的供體，而且它還賦予了蛋白質更多的非營養學功能，其作為胃腸道的“腔內信號分子”學說越來越被學術界所接受[1]。

以往的研究對于乳源生物活性肽[2]、大豆活性肽[3]報道的較多，而對于小麥肽的報道相對較少，目前小麥活性肽的制備、鑒定技術相對已經比較成熟，已有的關于小麥肽的體外實驗結果顯示，小麥活性肽具有豐富的生物學功能，如：阿片活性[4-5]、抑癌活性[6]、抑制ACE活性[7-8]、抗氧化等。外文報道的有關小麥活性肽的體內實驗幾乎是空白，僅有的國內文獻對于小麥肽體內實驗的報道也停留在現象觀察階段，如：鎮痛作用[9]、免疫調節[10]等，缺乏深入的研究。所以本實驗通過灌胃不同劑量的小麥肽，觀察小麥肽對大鼠氮代謝、血生化、胃腸形態以及小腸部分酶活的影響，為揭示其是否作為信號分子參與生理活動提供實驗基礎；也為小麥肽作為一種功能性食品，更好地服務人類健康提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

清潔級SD大鼠50只，雄性，體質量180～200g，購于浙江省實驗動物中心(許可證號：SCXK(浙)2008-0033)；標準鼠糧，購于南京市江寧區青龍山實驗動物繁殖場；大鼠飼養于東南大學環境醫學工程教育部重點實驗室動物房。

小麥肽，由中國食品發酵工業研究院提供，平均分子質量小于1000D的低分子肽混合物，比例達到92%，基本上是由2～6個氨基酸構成。

考馬斯亮藍蛋白濃度測試盒、Na+-K+-ATP酶活力測定試劑盒 南京建成生物工程研究所；其他均為國產分析純。

K9860自動凱氏定氮儀 中國海能儀器公司；LX20全自動生化分析儀 美國貝克曼庫爾特公司；Hitachi S-3000N掃描電鏡、HCP22型臨界點干燥儀 日本日立公司；722N可見光分光光度計 上海精密儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 動物分組和樣品采集

50只SD大鼠隨機分為5組，分別是空白對照組、低劑量小麥肽組(灌胃劑量為20mg/(kg·d))、中劑量小麥肽組(灌胃劑量為100mg/(kg·d))、高劑量小麥肽組(灌胃劑量為500mg/(kg·d))和小麥蛋白組(灌胃劑量為20mg/(kg·d))。低、中、高小麥肽劑量組每天用不同質量濃度的小麥肽溶液1mL灌胃，小麥蛋白組每天用小麥蛋白溶液1mL灌胃，空白對照組大鼠每天按等體積蒸餾水灌胃，灌胃共30d。

灌胃實驗開始前記錄大鼠初體質量，第10、20、30天記錄所有大鼠體質量、給料量、殘余料量，用代謝籠采集所有大鼠24h糞、尿樣品。每次收集的糞便稱質量后按鮮質量的5%加入10%硫酸溶液，并加少量甲苯防腐，保存于－20℃備用；每次收集的尿液中每100mL加入2mL的10%硫酸溶液，加4滴甲苯用于防腐，保存于－20℃備用。30d后，股動脈采血后頸部脫臼處死所有大鼠，取血清、胃、小腸黏膜組織，－70℃保存備用。

1.2.2 氮代謝測定指標及方法[11]

根據第10、20、30天的給料量和殘余料量，計算攝食量。

凱氏定氮法測定樣品中粗蛋白質含量(包括攝入氮、糞氮和尿氮)。

1.2.3 血清生化指標的測定

全自動生化分析儀測定大鼠血清中總蛋白、白蛋白、葡萄糖、甘油三酯、總膽固醇的含量。

1.2.4 胃腸道內表面掃描電鏡觀察

取材時，在胃竇處(十二指腸處)取一塊胃(小腸)組織放入生理鹽水中，輕輕洗滌，去除雜物。用體積分數2.5%的戊二醛和體積分數2%的四氧化鋨雙重固定，常規乙醇系列脫水，醋酸異戊酯過渡，在HCP22型臨界點干燥儀上干燥，噴金后在Hitachi S-3000N掃描電鏡下觀察。

1.2.5 胃、小腸組織蛋白含量的測定

按考馬斯亮藍蛋白濃度測試試劑盒說明書操作。

1.2.6 小腸黏膜氨基肽酶、Na+-K+-ATP酶活力的測定

樣本前處理：準確稱取腸黏膜組織50mg，加入生理鹽水450μL制成10%的勻漿，3500r/min離心10min，取上清液再用生理鹽水按體積比1：4稀釋成2%的勻漿待測。

氨基肽酶活力的測定[12]：取2%的勻漿液20μL，加入5mmol/L L-亮氨酸-4-硝基苯胺0.2mL 50mmol/L磷酸緩沖液(pH7.8) 0.4mL、蒸餾水0.38mL，37℃水浴60min；加入0.2mol/L醋酸鹽緩沖液(pH4.2) 3mL混勻，終止反應；分光光度計(波長405nm)檢測吸光度。酶活力單位為每分鐘水解1μmol的底物所需的酶量，酶活力以U/mg pro表示。

Na+-K+-ATP酶活力測定按試劑盒說明書進行。

1.2.7 統計學處理

用SPSS 13.0統計軟件進行統計分析。數據以±s表示，采用單因素方差分析，組間兩兩比較用t檢驗。P＜0.05為差別有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 氮代謝相關指標的測定結果

表 1 第10天大鼠氮代謝相關指標的變化(±s，n=10)Table 1 Changes of the nitrogen metabolism index after 10 days of treatment(±s，n=10)

表 1 第10天大鼠氮代謝相關指標的變化(±s，n=10)Table 1 Changes of the nitrogen metabolism index after 10 days of treatment(±s，n=10)

注：*.與空白對照組相比，有顯著性差異(P ＜0.05)。下同。

蛋白質生物學價值/%空白對照組73±72.32±0.7543±658±7低劑量小麥肽組 72±62.22±0.7446±861±10中劑量小麥肽組 73±62.70±0.65* 48±864±8高劑量小麥肽組 72±72.10±0.6741±755±9小麥蛋白組70±82.07±0.70* 40±653±11分組 蛋白質消化率/%氮沉積/(g/d)凈蛋白質利用率/%

由表1可知，灌胃不同劑量小麥肽和小麥蛋白10d后，與空白對照組相比，中劑量小麥肽能顯著增加大鼠氮沉積(P＜0.05)，小麥蛋白能顯著減少大鼠氮沉積(P＜0.05)，低、高劑量小麥肽對大鼠氮沉積無明顯影響。低、中劑量小麥肽組凈蛋白質利用率、蛋白質生物學價值均高于空白對照組，但無顯著性差異。

表 2 第20天大鼠氮代謝相關指標的變化(±s，n=10)Table 2 Changes of the nitrogen metabolism index after 20 days of treatment (±s，n=10)

表 2 第20天大鼠氮代謝相關指標的變化(±s，n=10)Table 2 Changes of the nitrogen metabolism index after 20 days of treatment (±s，n=10)

蛋白質生物學價值/%空白對照組73±72.98±0.6942±1257±7低劑量小麥肽組 78±63.22±0.7650±1663±9中劑量小麥肽組 74±63.00±0.6549±763±8高劑量小麥肽組 72±62.86±0.6742±1454±8小麥蛋白組70±62.23±0.75*37±1551±10分組 蛋白質消化率/%氮沉積/(g/d)凈蛋白質利用率/%

由表2可知，灌胃不同劑量小麥肽和小麥蛋白20d后，與空白對照組相比，小麥蛋白能顯著減少大鼠氮沉積(P＜0.05)，低、中、高劑量小麥肽對大鼠氮沉積無影響。低、中劑量小麥肽組凈蛋白質利用率、蛋白質生物學價值均高于空白對照組，但無顯著性差異。

表 3 第30天大鼠氮代謝相關指標的變化(±s，n=10)Table 3 Changes of the nitrogen metabolism index after 30 days of treatment (±s，n=10)

表 3 第30天大鼠氮代謝相關指標的變化(±s，n=10)Table 3 Changes of the nitrogen metabolism index after 30 days of treatment (±s，n=10)

蛋白質生物學價值/%空白對照組75±63.56±0.5741±1354±15低劑量小麥肽組 83±7*4.11±0.73*59±7*68±6*中劑量小麥肽組 72±33.87±0.4150±468±5*高劑量小麥肽組 70±52.88±0.58*42±1359±14小麥蛋白組68±6*2.80±0.59*34±1450±15分組 蛋白質消化率/%氮沉積/(g/d)凈蛋白質利用率/%

由表3可知，灌胃不同劑量小麥肽和小麥蛋白30d后，與空白對照組相比，低劑量小麥肽能顯著提高大鼠蛋白質消化率(P＜0.05)，小麥蛋白能顯著減少大鼠蛋白質消化率(P＜0.05)，中、高劑量小麥肽對大鼠蛋白質消化率無影響；低劑量小麥肽能顯著增加大鼠氮沉積(P＜0.05)，高劑量小麥肽、小麥蛋白能顯著減少大鼠氮沉積(P＜0.05)，中劑量小麥肽對大鼠氮沉積無影響；低劑量小麥肽能顯著增加大鼠凈蛋白質利用率(P＜0.05)，中、高劑量小麥肽和小麥蛋白對大鼠凈蛋白質利用率無影響；低、中劑量小麥肽均能顯著增加蛋白質生物學價值(P＜0.05)，而高劑量小麥肽和小麥蛋白對大鼠的蛋白質生物學價值均無影響。

2.2 血清生化指標的測定結果

表 4 小麥肽對大鼠血清生化指標的影響(±s，n=10)Table 4 Effect of wheat peptide on serum biochemical indicator in (±s，n=10)

表 4 小麥肽對大鼠血清生化指標的影響(±s，n=10)Table 4 Effect of wheat peptide on serum biochemical indicator in (±s，n=10)

總膽固醇含量/(mmol/L)空白對照組 57.89±1.05 18.11±1.17 8.28±1.020.72±0.211.92±0.22低劑量小麥肽組60.40±2.72* 18.50±0.71 8.97±0.590.96±0.28* 2.09±0.28中劑量小麥肽組60.30±1.83* 18.40±1.58 8.29±1.680.77±0.191.95±0.25高劑量小麥肽組61.10±1.85* 17.60±1.90 8.30±0.940.75±0.211.89±0.34小麥蛋白組 58.40±1.26 18.90±1.29 8.72±0.810.76±0.262.04±0.21分組 總蛋白含量/(g/L)白蛋白含量/(g/L)葡萄糖含量/(mmol/L)甘油三酯含量/(mmol/L)

如表4所示，低、中、高劑量小麥肽組大鼠血清總蛋白含量均顯著高于空白對照組(P＜0.05)，而小麥蛋白組大鼠血清總蛋白與空白對照組相比無顯著性差異。低劑量小麥肽組大鼠血清甘油三酯含量要顯著高于空白對照組(P＜0.05)，中、高劑量小麥肽組和小麥蛋白組大鼠血清甘油三酯含量與空白對照組相比無顯著性差異。低、中、高劑量小麥肽組和小麥蛋白組大鼠血清白蛋白、葡萄糖、總膽固醇與空白對照組相比均無明顯差異。

2.3 胃腸道掃描電鏡結果

2.3.1 小麥肽對大鼠胃黏膜上皮細胞結構和形態的影響

圖 1 大鼠胃內表面掃描電鏡結果的比較(×500)Fig.1 Scanning electron microscope images of gaster surface (×500)

如圖1所示，空白對照組胃表面平整，上皮細胞游離面細胞界限明顯，細胞間連接緊密，排列整齊，胃小凹分布均勻，開口處多近三角形或橢圓型。灌胃30d后，低、中劑量小麥肽對胃表面上皮細胞的生長有一定的促進作用，體現為上皮細胞排列整齊有序，細胞間隙緊密，上皮細胞形態飽滿。高劑量小麥肽組和小麥蛋白組胃表面與空白對照組一致。

2.3.2 小麥肽對大鼠十二指腸黏膜上皮細胞結構和形態的影響

圖 2 大鼠十二指腸內表面掃描電鏡結果的比較(×400)Fig.2 Scanning electron microscope images of dodecadactylon surface (×400)

如圖2所示，灌胃30d后，低、中劑量組大鼠的十二指腸絨毛生長情況要優于空白對照組，主要表現為低、中劑量組大鼠十二指腸表面上皮細胞排列密集，且排列整齊有序，細胞間隙清晰，上皮細胞飽滿；而高劑量小麥肽和小麥蛋白組大鼠的腸絨毛生長情況與空白對照組一致。

2.4 胃腸組織蛋白含量的測定結果

圖 3 小麥肽對大鼠胃組織蛋白含量的影響(±s，n=10)Fig.3 Effect of wheat peptide on the protein level in gaster (±s，n=10)

圖 4 小麥肽對大鼠小腸黏膜蛋白含量的影響(±s，n=10)Fig.4 Effect of wheat peptide on the protein level in small intestine mucosa mucosa (±s，n=10)

如圖3、4所示，低、中、高劑量小麥肽組和小麥蛋白組大鼠胃組織蛋白含量與空白對照組相比無顯著性差異；另外低、中、高劑量小麥肽組和小麥蛋白組大鼠小腸黏膜組織中蛋白含量與空白對照組相比無顯著性差異。

2.5 小腸黏膜氨基肽酶、Na+-K+-ATP酶活力的測定結果

圖 5 小麥肽對大鼠小腸黏膜氨基肽酶活力的影響(±s，n=10)Fig.5 Effect of wheat peptide on aminopeptidase activity in small intestine mucosa (±s，n=10)

如圖5所示，低、中、高劑量小麥肽組大鼠小腸黏膜氨基肽酶活力要顯著高于空白對照組(P＜0.05)，小麥蛋白組大鼠小腸黏膜氨基肽酶活力與空白對照組相比無顯著性差異。

如圖6所示，中、高劑量小麥肽組大鼠小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力要顯著高于空白對照組(P＜0.05)，低劑量小麥肽和小麥蛋白組大鼠小腸黏膜Na+-K+-ATP酶活力與空白對照組相比無顯著性差異。

3 討 論

機體攝入的食物中的含氮營養物質經過體內消化、吸收與代謝，一部分合成了機體內蛋白，沉積于體內或者被機體所利用，另一部分經過代謝變為廢棄產物隨尿等排出，構成了機體的氮代謝[13]。糞中含有的氮和尿中的氮是攝入氮的兩個主要損失的部分，糞氮是經過消化道之后而沒有被消化、吸收的部分，尿氮是被吸收以后的氨基酸或者小肽參與組織代謝后，沒有被利用合成機體內蛋白而脫氨后由尿排出的部分。

蛋白質消化率是動物攝入的蛋白質(或氮)減去糞中的蛋白質(或氮)占攝入的蛋白質(或氮)的百分比，可以衡量飼料蛋白質被消化的程度。大鼠對飼料中蛋白質利用率越低，則通過代謝糞氮損失的蛋白質相對越多，消化的相對越少，消化率相對越低。灌胃30d后，低劑量小麥肽組蛋白質消化率顯著高于空白對照組(P＜0.05)；而小麥蛋白組蛋白質消化率要顯著低于空白組(P＜0.05)，Auricchio等[14]曾報道小麥蛋白與乳糜瀉(腹部疾病)的發病有很大的關聯，推測小麥蛋白有可能降低大鼠的蛋白質消化率。

凈蛋白質利用率是指動物體內沉積的蛋白質(或氮)占食入的蛋白質(或氮)的百分比，蛋白質生物學價值是指體內沉積的蛋白質(或氮)占食物中被消化的蛋白質(或氮)的百分比。凈蛋白質利用率和蛋白質生物學價值用來衡量飼料蛋白質被利用的程度。Boze等[15]研究結果表明飼料中添加小肽，可顯著提高動物對蛋白質的利用率。本實驗發現灌胃10d和20d后，低、中劑量小麥肽均能提高大鼠凈蛋白質利用率和蛋白質生物學價值，并且灌胃30d后，低劑量小麥肽能顯著提高大鼠凈蛋白質利用率和蛋白質生物學價值，中劑量小麥肽能顯著提高大鼠蛋白質生物學價值，與Boze報道一致；高劑量小麥肽和小麥蛋白對大鼠凈蛋白質利用率和蛋白質生物學價值均無影響，推測小麥肽作為一種信號分子參與調控機體利用食物中蛋白質，體現了小麥肽的非營養學功能。

目前，胃腸腔內食物的消化產物是胃、小腸上皮細胞生長的重要的刺激因素的觀點已被普遍接受。由于胃、小腸是機體與消化道內營養微環境之間的重要界面，其形態和功能的改變受許多因素的影響，如內分泌激素、胃腸調節蛋白、一些生長因子以及膳食營養等。Mane等[16]研究顯示，胃、小腸內容物及消化產物可刺激胃與小腸上皮組織形態結構的改變。本實驗發現小麥肽對大鼠胃腸道上皮細胞的生長有一定的促進作用，與王恬等的研究結果一致。

食物蛋白質經小腸腔內消化液的消化后2/3的肽類物質需進一步經小腸上皮細胞紋狀緣肽酶表面水解或轉運入細胞由細胞漿肽酶水解后才被吸收。因此小腸黏膜紋狀緣氨基肽酶是蛋白質消化的關鍵酶[16]。氨基肽酶廣泛分布在小腸黏膜上皮細胞的紋狀緣上，氨基肽酶是一種蛋白質水解酶，能水解蛋白質和多肽的N末端氨基酸，使蛋白質的水解產物進一步水解為肽與氨基酸，對飼料蛋白質的充分消化吸收和氮的利用方面具重要作用。本實驗發現不同劑量的小麥肽均能顯著提高大鼠小腸黏膜氨基肽酶的活力。大部分營養物質(例如氨基酸、葡萄糖)的吸收是在通過小腸黏膜進行[17]，氨基酸的吸收屬于主動運輸，需要Na+-K+-ATP酶來提供能量。本研究結果顯示中、高劑量的小麥肽均能顯著提高大鼠的Na+-K+-ATP酶活力。提示小麥肽可能是通過上調這兩種酶的活性來增加腸道內肽和氨基酸的生成和吸收的。另外本實驗的血清生化指標結果顯示，低、中、高劑量小麥肽均能顯著提高大鼠血清總蛋白的水平，也提示小麥肽對機體對于蛋白質的生物利用是有影響的。

本研究結果也證實了小麥蛋白本身沒有影響大鼠氮代謝、血生化、胃腸形態與功能的作用。由于小麥活性肽是以無活性的形式隱藏在小麥蛋白的氨基酸序列中，必須通過適當的酶解，在一定條件下才能釋放出來，發揮其豐富的生物學功能。故研究認為小麥肽是發揮生物學作用的主要有效成分。

綜上所述，小麥活性肽處理組大鼠在蛋白質消化率、凈蛋白質利用率和生物學效價等指標上的提高，增加了機體對于食物蛋白質的消化與利用，可能與其能促進胃腸道上皮細胞的生長，另外其能上調大鼠小腸黏膜的氨基肽酶、Na+-K+-ATP酶的活性有關。而小麥蛋白本身無以上作用。本研究中涉及的分子機制需要進一步研究。

[1] 宗亞峰. β酪啡肽在胃腸道內的釋放、吸收和穩定特性及其對胃腸機能的影響[D]. 南京： 南京農業大學, 2007.

[2] CLARE D A, SWAISGOOD H E. Bioactive milk peptides： a prospectus[J]. Journal of Dairy Science, 2000, 83(6)： 1187-1195.

[3] KITTS D D, WEILER K. Bioactive proteins and peptides from food sources. Applications of bioprocesses used in isolation and recovery[J]. Current Pharmaceutical Design, 2003, 9(16)： 1309-1323.

[4] HUEBNER F R, LIEBERMAN K W, RUBINO R P, et al. Demonstration of high opioid-like activity in isolated peptides from wheat gluten hydrolysates[J]. Peptides, 1984, 5(6)： 1139-1147.

[5] SHIN-ICHI F, MASAAKI Y. Opioid peptides derived from wheat gluten： their isolation and characterization[J]. FEBS Letters, 1992, 296(1)： 107-111.

[6] CALZUOLA I, GIAVARINI F, SASSI P, et al. Short acidic peptides isolated from wheat sprout chromatin and involved in the control of cell proliferation characterization by infrared spectroscopy and mass spectrometry[J]. Peptides, 2005, 26： 2074-2085.

[7] MOTOI H, KODAMA T. Isolation and characterization of angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides from wheat gliadin hydrolysate[J]. Nahrung-Food, 2003, 47(5)： 354-358.

[8] JIA Junqiang, MA Haile, ZHAO Weirui, et al. The use of ultrasound for enzymatic preparation of ACE-inhibitory peptides from wheat germ protein[J]. Food Chemistry, 2010, 119： 336-342.

[9] 孔祥珍, 周惠明, 錢海峰. 小麥面筋蛋白短肽的鎮痛作用研究[J]. 食品與生物技術學報, 2007, 26(2)： 26-29.

[10] 代卉, 樂國偉, 孫進, 等. 小麥肽對受環磷酰胺免疫抑制小鼠的免疫調節及抗氧化功能[J]. 生物工程學報, 2009, 25(4)： 549-553.

[11] 戴求仲, 王康寧, 胡艷, 等. 不同淀粉來源對生長豬氮代謝及血液部分生化指標的影響[J]. 動物營養學報, 2009, 21(5)： 617-624.

[12] 葉麗萍, 龔四堂. 正常大鼠小腸黏膜紋狀緣氨基肽酶活性的研究[J]. 廣東醫學, 2008, 29(5)： 746-747.

[13] LI Zhentian, LI Defa, QIAO Shiyan. Effects of soybean agglutinin on nitrogen metabolism and on characteristics of intestinal tissues and pancreas in rats[J]. Arch Anim Nutr, 2003, 57(5)： 369-380.

[14] AURICCHIO S, de RITIS G, de VINCENZI M, et al. Toxicity mechanisms of wheat and other cereals in celiac disease and related enteropaties[J]. J Ped Gastr Nutr, 1985, 4： 923-930.

[15] BOZE J J, MOENNOZ D, VUICHOUD J, et al. Protein hydrolysate vs free amino acid-based diets on the nutritional recovery of the starved rat[J]. European Journal of Nutrition, 2000, 39(6)： 237-243.

[16] MANE S, GADE W, JAMDAR S. Purification and characterization of proline aminopeptidase from chicken intestine[J]. Process Biochemistry, 2011, 46(6)： 1384-1389.

[17] 鄒思湘. 動物生物化學[M]. 4版. 北京： 中國農業出版社, 2005： 102-103.