響應面法優化黃粉蟲黃酮提取工藝

汪 璇，張建新*，孫長江，汪曉玉

(西北農林科技大學食品科學與工程學院，陜西 楊凌 712100)

黃粉蟲(Tenebrio molitor Linnaeus)又稱大黃粉蟲、黃粉甲，俗稱“面包蟲”。隸屬于昆蟲綱(Insecta)、鞘翅目(Coleoptera)、擬步甲科(Tenebrionidae)、粉甲屬(Tenebrionini)[1]。世界性分布，原產于美洲，20世紀50年代由前蘇聯傳入我國[2]。現廣泛分布于我國的黑龍江、遼寧、甘肅、陜西、四川、山東、湖北等省區[3]。黃粉蟲含有豐富的蛋白質、脂肪、維生素、甲殼素、多糖、礦物質等多種營養成分。黃粉蟲干粉的蛋白質含量在48%～54%之間，不飽和脂肪酸含量較高[4]。

黃酮類化合物是自然界中存在的一大類天然多酚化合物，廣泛存在于水果、蔬菜、堅果、谷物、茶、酒、蜂膠等膳食中[5]。黃酮類化合物具有抗癌、防止心血管疾病、抗氧化、清除自由基[6]、抗病毒、抑菌[7]等生物活性作用。目前，國內外對植物體內黃酮類化合物的報道很多[8-9]，而昆蟲體內黃酮類化合物的報道較少。近年來，對于黃粉蟲的研究，主要涉及蛋白質[10]、抗氧化肽[11]、抗菌肽[12]、油[13]、殼聚糖[14]、多糖[15]的提取，但對于黃粉蟲黃酮類化合物的提取還未見研究報道。本實驗采用超聲波水提取黃粉蟲黃酮，并應用響應面法優化提取工藝，旨在確定黃粉蟲黃酮提取工藝參數。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃粉蟲 陜西秦蟲黃粉蟲科技發展有限公司；蘆丁標準品(純度≥95%) 國藥集團化學試劑有限公司；無水乙醇、石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(均為分析純)。

1.2 儀器與設備

KQ-600DB型數控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長城精工儀器有限公司；UV-2550型紫外分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 黃粉蟲黃酮提取工藝流程

黃粉蟲烘干樣品→破碎→石油醚脫脂8h→粉碎過篩40目→超聲波水浸提→抽濾→定容→測定黃酮提取量

1.3.2 標準溶液的配制

稱取干燥至質量恒定的蘆丁標準品10mg，用80%乙醇溶液溶解，轉移至50mL容量瓶中定容，此標準溶液質量濃度為0.2mg/mL。

1.3.3 黃粉蟲黃酮鑒定和波長的選擇

取1mL上述標準溶液于10mL具塞刻度試管中，加80%乙醇溶液至5mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻后靜置6min；加10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻后靜置6min；加入1.0mol/L氫氧化鈉溶液4mL，加80%乙醇溶液至刻度，搖勻后靜置15min；在400～700nm波長之間測定吸光度。

稱取5.0g脫脂黃粉蟲粉至三角瓶中，加入100mL蒸餾水，在溫度60℃、超聲功率360W條件下超聲30min。抽濾后，吸取1mL提取液于10mL具塞刻度試管中。按上述方法在400～700nm波長之間測定吸收光譜。如圖1所示，結果表明蘆丁標準溶液與樣品溶液均在510nm左右有最大吸收峰值，可知提取液中含有黃酮類化合物。因此，波長確定為510nm。

圖 1 標準液與樣品液光譜掃描圖Fig.1 Absorption spectra of rutin standard solution and sample solution

1.3.4 標準曲線的制作

分別量取標準溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL具塞刻度試管中，以下同1.3.3節的實驗步驟。在510nm的波長處測定吸光度(A)，得標準曲線的回歸方程為：A＝10.39C－0.011(C為質量濃度/(mg/mL)；A為吸光度；決定系數R2＝0.9996)。

1.3.5 黃粉蟲黃酮的測定

準確稱取1.0g脫脂黃粉蟲粉至三角瓶中，按照要求加入一定量的提取劑，在一定溫度、功率下超聲浸提一定時間，抽濾，濾液用提取劑定容于100mL的容量瓶中，作為待測液。

取1mL待測液于10mL具塞試管中，按標準曲線的測定方法和步驟于510nm波長處測定吸光度，根據標準曲線方程計算樣品中黃酮的提取量(mg/g)。

1.4 Box-Behnken試驗設計

在單因素試驗結果的基礎上，對液料比、超聲時間、浸提溫度和超聲功率4個影響黃粉蟲黃酮提取量的主要因素進行優化試驗。采用四因素三水平Box-Behnken試驗優化工藝條件。試驗設計與統計分析軟件為Desigh-Expert 7.0 Trial。試驗因素水平設計見表1。

表 1 響應面分析因素與水平表Table1 Variables and their coded levels used in response surface analysis

2 結果與分析

2.1 提取劑的選擇

稱取2g脫脂黃粉蟲粉于三角瓶中，依次加入60mL蒸餾水，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液。在浸提溫度65℃、超聲功率420W條件下超聲40min。減壓抽濾，定容于100mL的容量瓶中，測定黃粉蟲黃酮提取量，結果如圖2所示。結果表明，蒸餾水對黃粉蟲黃酮的提取效果更好，利用不同體積分數的乙醇溶液提取黃粉蟲黃酮的效果隨乙醇體積分數的增大而依次降低。加之，水提取成本低，無污染，效率高，而乙醇溶液提取成本高，安全性低，還可能造成環境污染。因此，本實驗選用蒸餾水作為提取劑來提取黃粉蟲黃酮。

圖 2 提取劑對黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of extraction solvents on the yield of fl avonoids from Tenebrio molitor

2.2 黃粉蟲黃酮提取單因素試驗

2.2.1 液料比對黃粉蟲黃酮提取量的影響

稱取5份1g脫脂黃粉蟲粉，分別加入10、20、30、40、50mL蒸餾水，在浸提溫度60℃、超聲功率420W的條件下超聲提取40min，結果見圖3。結果表明，黃粉蟲黃酮提取量隨液料比的增大而呈先上升后下降的趨勢，當液料比為20：1(mL/g)時，黃酮提取量達最大值。這可能是因為提取劑用量越多，脫脂黃粉蟲粉與水接觸得越充分，所以黃酮的提取量呈上升趨勢。但是在一定的超聲條件下，液料比越大，溶質所受的機械剪切力越小。綜合考慮，液料比定為10：1～30：1。

圖 3 液料比對黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of fl avonoids from Tenebrio molitor

2.2.2 超聲時間對黃粉蟲黃酮提取量的影響

稱取5份1g脫脂黃粉蟲粉，加入20mL蒸餾水，在浸提溫度60℃、超聲功率420W條件下分別超聲提取10、20、30、40、50min，結果見圖4。結果表明，黃粉蟲黃酮的提取量隨時間的延長呈先上升后降低的趨勢，當提取時間為40min時，提取量最大。這可能是因為隨時間的延長，黃酮的溶出率逐漸增加，但提取時間越長，雜質的溶出量也相應增加，而提取量反而下降，因此提取時間為50min時，提取量迅速降低[16]。綜合考慮，提取時間定為20～40min。

圖 4 超聲時間對黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of fl avonoids from Tenebrio molitor

2.2.3 浸提溫度對黃粉蟲黃酮提取量的影響

稱取5份1g脫脂黃粉蟲粉，加入20mL蒸餾水，分別在浸提溫度為40、50、60、70、80℃，超聲功率420W的條件下超聲提取30min，結果見圖5。結果表明，黃粉蟲黃酮提取量隨溫度的升高呈先上升后下降的趨勢，當溫度達到50℃時提取量最大。這可能是因為，溫度升高有利于黃酮的溶出，但溫度過高，引起黃酮物質結構發生變化，破壞黃酮物質[17]。綜合考慮，提取溫度定為50～70℃。

圖 5 浸提溫度對黃粉蟲黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield of fl avonoids from Tenebrio molitor

圖 6 超聲功率對黃酮提取量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on the yield of fl avonoids from Tenebrio molitor

2.2.4 超聲功率對黃粉蟲黃酮提取量的影響

稱取5份1g脫脂黃粉蟲粉，加入20mL蒸餾水，在浸提溫度50℃，分別在超聲功率300、360、420、480、540W條件下超聲提取40min，結果見圖6。結果表明，黃粉蟲黃酮提取量隨超聲波功率的增加呈先上升后下降的趨勢。當超聲功率為360W時，提取量最大。這可能是因為，隨著超聲功率的增大，機械剪切力使黃酮逐漸溶出，但超聲功率過大，引起黃酮結構發生變化。同時，一些能使黃酮類化合物降解的酶也被釋放出來，從而提取量逐漸降低[18]。綜合考慮，提取功率定為300～420W。

2.3 黃粉蟲黃酮提取工藝優化

2.3.1 黃粉蟲黃酮提取量的方差分析

采用Design-Expert 7.0 Trial軟件，按照Box-Behnken組合設計，依據單因素試驗結果選取液料比、超聲時間、浸提溫度、超聲功率4因素作為自變量，以黃粉蟲黃酮提取量作為響應值。試驗設計方案及數據處理結果見表2，方差分析結果見表3。

表 2 Box-Behnken 設計方案及響應值結果Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding results

對表2結果進行統計分析，可建立如下二次回歸方程(編碼方程)：

表 3 響應面二次模型方差分析(Ⅰ)Table 3 Analysis of variance of the original quadratic regression model for the yield of flavonoids

從表3分析得出，該二次回歸方程的模型項、二次項A2、B2都表現出極顯著影響，一次項B、D，二次項C2、D2，交互項AD、BD都表現出顯著影響，而且失擬項不顯著，表明該模型有顯著意義。為了簡化二次回歸方程，剔除偏回歸系數不顯著的AB、BC、CD項，可建立如下二次回歸方程(編碼方程)：

表 4 響應面二次模型方差分析(Ⅱ)Table 4 Analysis of variance of the simplififi ed quadratic regression model for the yield of flavonoids

由表4分析得出，剔除不顯著項后，該模型的F值由5.76變為7.20，表明經簡化后，該模型更顯著，而且交互項及二次項影響顯著，失擬項不顯著，模型預測值和實際值擬合較好。由P值可知，在各因素所選的范圍內，對黃酮提取量影響的大小依次為B(超聲時間)＞D(超聲功率)＞A(液料比)＞C(浸提溫度)。經Design-Expert 7.0 Trial 軟件分析得到，回歸方程的相關系數R2為0.8234，由此可知，液料比、超聲時間、浸提溫度、超聲功率對黃酮提取量的影響不是簡單的線性關系。變異系數為2.32%，說明該模型的精密度較好。綜上所述，建立的回歸方程能代替試驗真實點來解釋響應結果。

2.3.2 響應面分析

等高線的形狀反映交互效應的強弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[19]。圖7、8可知，液料比與超聲功率(AD)、超聲時間與超聲功率(BD)的交互作用對黃粉蟲黃酮的提取量影響顯著。同時，由兩組圖可知，在所選范圍內存在極值點，即響應面最高點，也是等高線最小橢圓的中心點(5點)。

圖 7 液料比和超聲功率交互作用對黃酮提取量的影響Fig.7 Response surface and contour plots showing the effect of liquidto-solid ratio and ultrasonic power on the yield of fl avonoids

圖 8 超聲時間和超聲功率交互作用對黃酮提取量的影響Fig.8 Response surface and contour plots showing the effect of ultrasonic treatment time and power on the yield of fl avonoids

圖7表示超聲時間為30min，浸提溫度為50℃時，液料比與超聲功率對黃酮提取量的影響。當超聲功率一定時，黃酮提取量隨液料比增大先增大后減小，當液料比小于18：1(mL/g)時，黃酮提取量逐漸增大；當液料比一定是，黃酮提取量隨超聲功率的增加而增大，當大于380W時，趨于緩和。

圖8表示液料比20：1(mL/g)，超聲溫度50℃時，超聲時間和超聲功率對黃酮提取量的影響。當超聲功率一定時，黃酮提取量隨超聲時間的延長先增大后逐漸減小，在超聲時間為30min之前，黃酮提取量逐漸增加；當超聲時間一定時，黃酮提取量隨超聲功率的增加而增大，當功率達380W時，趨于緩和。

由Design-Expert 7.0 Trial軟件分析可知，超聲波輔助提取黃粉蟲黃酮的最優工藝參數為液料比18.34：1(mL/g)、超聲時間30.06min、浸提溫度58.43℃、超聲功率380.62W，在此優化條件下，黃粉蟲黃酮提取量的理論值11.58mg/g。結合實際試驗條件，最終選擇的實驗條件為液料比18：1(mL/g)、超聲時間30min、浸提溫度58℃、超聲功率380W。經驗證，得實際測得黃粉蟲黃酮提取量為11.47mg/g，與理論值基本一致，說明該方程與實際情況擬合很好，證明應用響應面優化條件來提高黃粉蟲黃酮提取量的方法可行。

3 結 論

本實驗采用響應面法對超聲波水提取黃粉蟲黃酮工藝進行優化，建立的二次多項式數學模型具有良好的顯著性。提取黃粉蟲黃酮的最佳工藝條件為液料比18.34：1(mL/g)、超聲時間31.06min、浸提溫度58.43℃、超聲功率380.62W，理論預測值為11.58mg/g，實際測量值為11.47mg/g。4種因素的影響大小依次為超聲時間、超聲功率、液料比、浸提溫度。超聲波水提取黃粉蟲黃酮，降低了生產成本，是一種安全、經濟和高效的提取方法。

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