響應(yīng)面法優(yōu)化黃粉蟲黃酮提取工藝

汪 璇，張建新*，孫長(zhǎng)江，汪曉玉

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

黃粉蟲(Tenebrio molitor Linnaeus)又稱大黃粉蟲、黃粉甲，俗稱“面包蟲”。隸屬于昆蟲綱(Insecta)、鞘翅目(Coleoptera)、擬步甲科(Tenebrionidae)、粉甲屬(Tenebrionini)[1]。世界性分布，原產(chǎn)于美洲，20世紀(jì)50年代由前蘇聯(lián)傳入我國(guó)[2]?，F(xiàn)廣泛分布于我國(guó)的黑龍江、遼寧、甘肅、陜西、四川、山東、湖北等省區(qū)[3]。黃粉蟲含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、維生素、甲殼素、多糖、礦物質(zhì)等多種營(yíng)養(yǎng)成分。黃粉蟲干粉的蛋白質(zhì)含量在48%～54%之間，不飽和脂肪酸含量較高[4]。

黃酮類化合物是自然界中存在的一大類天然多酚化合物，廣泛存在于水果、蔬菜、堅(jiān)果、谷物、茶、酒、蜂膠等膳食中[5]。黃酮類化合物具有抗癌、防止心血管疾病、抗氧化、清除自由基[6]、抗病毒、抑菌[7]等生物活性作用。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)植物體內(nèi)黃酮類化合物的報(bào)道很多[8-9]，而昆蟲體內(nèi)黃酮類化合物的報(bào)道較少。近年來，對(duì)于黃粉蟲的研究，主要涉及蛋白質(zhì)[10]、抗氧化肽[11]、抗菌肽[12]、油[13]、殼聚糖[14]、多糖[15]的提取，但對(duì)于黃粉蟲黃酮類化合物的提取還未見研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用超聲波水提取黃粉蟲黃酮，并應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，旨在確定黃粉蟲黃酮提取工藝參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃粉蟲 陜西秦蟲黃粉蟲科技發(fā)展有限公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥95%) 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、石油醚、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(均為分析純)。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-600DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵 鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鄭州長(zhǎng)城精工儀器有限公司；UV-2550型紫外分光光度計(jì) 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 黃粉蟲黃酮提取工藝流程

黃粉蟲烘干樣品→破碎→石油醚脫脂8h→粉碎過篩40目→超聲波水浸提→抽濾→定容→測(cè)定黃酮提取量

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

稱取干燥至質(zhì)量恒定的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用80%乙醇溶液溶解，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中定容，此標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度為0.2mg/mL。

1.3.3 黃粉蟲黃酮鑒定和波長(zhǎng)的選擇

取1mL上述標(biāo)準(zhǔn)溶液于10mL具塞刻度試管中，加80%乙醇溶液至5mL，加5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻后靜置6min；加10%硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻后靜置6min；加入1.0mol/L氫氧化鈉溶液4mL，加80%乙醇溶液至刻度，搖勻后靜置15min；在400～700nm波長(zhǎng)之間測(cè)定吸光度。

稱取5.0g脫脂黃粉蟲粉至三角瓶中，加入100mL蒸餾水，在溫度60℃、超聲功率360W條件下超聲30min。抽濾后，吸取1mL提取液于10mL具塞刻度試管中。按上述方法在400～700nm波長(zhǎng)之間測(cè)定吸收光譜。如圖1所示，結(jié)果表明蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液與樣品溶液均在510nm左右有最大吸收峰值，可知提取液中含有黃酮類化合物。因此，波長(zhǎng)確定為510nm。

圖 1 標(biāo)準(zhǔn)液與樣品液光譜掃描圖Fig.1 Absorption spectra of rutin standard solution and sample solution

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

分別量取標(biāo)準(zhǔn)溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于10mL具塞刻度試管中，以下同1.3.3節(jié)的實(shí)驗(yàn)步驟。在510nm的波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為：A＝10.39C－0.011(C為質(zhì)量濃度/(mg/mL)；A為吸光度；決定系數(shù)R2＝0.9996)。

1.3.5 黃粉蟲黃酮的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取1.0g脫脂黃粉蟲粉至三角瓶中，按照要求加入一定量的提取劑，在一定溫度、功率下超聲浸提一定時(shí)間，抽濾，濾液用提取劑定容于100mL的容量瓶中，作為待測(cè)液。

取1mL待測(cè)液于10mL具塞試管中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法和步驟于510nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算樣品中黃酮的提取量(mg/g)。

1.4 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，對(duì)液料比、超聲時(shí)間、浸提溫度和超聲功率4個(gè)影響黃粉蟲黃酮提取量的主要因素進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)。采用四因素三水平Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化工藝條件。試驗(yàn)設(shè)計(jì)與統(tǒng)計(jì)分析軟件為Desigh-Expert 7.0 Trial。試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)見表1。

表 1 響應(yīng)面分析因素與水平表Table1 Variables and their coded levels used in response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑的選擇

稱取2g脫脂黃粉蟲粉于三角瓶中，依次加入60mL蒸餾水，10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%的乙醇溶液。在浸提溫度65℃、超聲功率420W條件下超聲40min。減壓抽濾，定容于100mL的容量瓶中，測(cè)定黃粉蟲黃酮提取量，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，蒸餾水對(duì)黃粉蟲黃酮的提取效果更好，利用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液提取黃粉蟲黃酮的效果隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大而依次降低。加之，水提取成本低，無污染，效率高，而乙醇溶液提取成本高，安全性低，還可能造成環(huán)境污染。因此，本實(shí)驗(yàn)選用蒸餾水作為提取劑來提取黃粉蟲黃酮。

圖 2 提取劑對(duì)黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of extraction solvents on the yield of fl avonoids from Tenebrio molitor

2.2 黃粉蟲黃酮提取單因素試驗(yàn)

2.2.1 液料比對(duì)黃粉蟲黃酮提取量的影響

稱取5份1g脫脂黃粉蟲粉，分別加入10、20、30、40、50mL蒸餾水，在浸提溫度60℃、超聲功率420W的條件下超聲提取40min，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，黃粉蟲黃酮提取量隨液料比的增大而呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)液料比為20：1(mL/g)時(shí)，黃酮提取量達(dá)最大值。這可能是因?yàn)樘崛┯昧吭蕉?，脫脂黃粉蟲粉與水接觸得越充分，所以黃酮的提取量呈上升趨勢(shì)。但是在一定的超聲條件下，液料比越大，溶質(zhì)所受的機(jī)械剪切力越小。綜合考慮，液料比定為10：1～30：1。

圖 3 液料比對(duì)黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of liquid-to-solid ratio on the yield of fl avonoids from Tenebrio molitor

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)黃粉蟲黃酮提取量的影響

稱取5份1g脫脂黃粉蟲粉，加入20mL蒸餾水，在浸提溫度60℃、超聲功率420W條件下分別超聲提取10、20、30、40、50min，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，黃粉蟲黃酮的提取量隨時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后降低的趨勢(shì)，當(dāng)提取時(shí)間為40min時(shí)，提取量最大。這可能是因?yàn)殡S時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮的溶出率逐漸增加，但提取時(shí)間越長(zhǎng)，雜質(zhì)的溶出量也相應(yīng)增加，而提取量反而下降，因此提取時(shí)間為50min時(shí)，提取量迅速降低[16]。綜合考慮，提取時(shí)間定為20～40min。

圖 4 超聲時(shí)間對(duì)黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of extraction time on the yield of fl avonoids from Tenebrio molitor

2.2.3 浸提溫度對(duì)黃粉蟲黃酮提取量的影響

稱取5份1g脫脂黃粉蟲粉，加入20mL蒸餾水，分別在浸提溫度為40、50、60、70、80℃，超聲功率420W的條件下超聲提取30min，結(jié)果見圖5。結(jié)果表明，黃粉蟲黃酮提取量隨溫度的升高呈先上升后下降的趨勢(shì)，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)提取量最大。這可能是因?yàn)椋瑴囟壬哂欣邳S酮的溶出，但溫度過高，引起黃酮物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，破壞黃酮物質(zhì)[17]。綜合考慮，提取溫度定為50～70℃。

圖 5 浸提溫度對(duì)黃粉蟲黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of extraction temperature on the yield of fl avonoids from Tenebrio molitor

圖 6 超聲功率對(duì)黃酮提取量的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on the yield of fl avonoids from Tenebrio molitor

2.2.4 超聲功率對(duì)黃粉蟲黃酮提取量的影響

稱取5份1g脫脂黃粉蟲粉，加入20mL蒸餾水，在浸提溫度50℃，分別在超聲功率300、360、420、480、540W條件下超聲提取40min，結(jié)果見圖6。結(jié)果表明，黃粉蟲黃酮提取量隨超聲波功率的增加呈先上升后下降的趨勢(shì)。當(dāng)超聲功率為360W時(shí)，提取量最大。這可能是因?yàn)椋S著超聲功率的增大，機(jī)械剪切力使黃酮逐漸溶出，但超聲功率過大，引起黃酮結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。同時(shí)，一些能使黃酮類化合物降解的酶也被釋放出來，從而提取量逐漸降低[18]。綜合考慮，提取功率定為300～420W。

2.3 黃粉蟲黃酮提取工藝優(yōu)化

2.3.1 黃粉蟲黃酮提取量的方差分析

采用Design-Expert 7.0 Trial軟件，按照Box-Behnken組合設(shè)計(jì)，依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選取液料比、超聲時(shí)間、浸提溫度、超聲功率4因素作為自變量，以黃粉蟲黃酮提取量作為響應(yīng)值。試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及數(shù)據(jù)處理結(jié)果見表2，方差分析結(jié)果見表3。

表 2 Box-Behnken 設(shè)計(jì)方案及響應(yīng)值結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and corresponding results

對(duì)表2結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，可建立如下二次回歸方程(編碼方程)：

表 3 響應(yīng)面二次模型方差分析(Ⅰ)Table 3 Analysis of variance of the original quadratic regression model for the yield of flavonoids

從表3分析得出，該二次回歸方程的模型項(xiàng)、二次項(xiàng)A2、B2都表現(xiàn)出極顯著影響，一次項(xiàng)B、D，二次項(xiàng)C2、D2，交互項(xiàng)AD、BD都表現(xiàn)出顯著影響，而且失擬項(xiàng)不顯著，表明該模型有顯著意義。為了簡(jiǎn)化二次回歸方程，剔除偏回歸系數(shù)不顯著的AB、BC、CD項(xiàng)，可建立如下二次回歸方程(編碼方程)：

表 4 響應(yīng)面二次模型方差分析(Ⅱ)Table 4 Analysis of variance of the simplififi ed quadratic regression model for the yield of flavonoids

由表4分析得出，剔除不顯著項(xiàng)后，該模型的F值由5.76變?yōu)?.20，表明經(jīng)簡(jiǎn)化后，該模型更顯著，而且交互項(xiàng)及二次項(xiàng)影響顯著，失擬項(xiàng)不顯著，模型預(yù)測(cè)值和實(shí)際值擬合較好。由P值可知，在各因素所選的范圍內(nèi)，對(duì)黃酮提取量影響的大小依次為B(超聲時(shí)間)＞D(超聲功率)＞A(液料比)＞C(浸提溫度)。經(jīng)Design-Expert 7.0 Trial 軟件分析得到，回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0.8234，由此可知，液料比、超聲時(shí)間、浸提溫度、超聲功率對(duì)黃酮提取量的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。變異系數(shù)為2.32%，說明該模型的精密度較好。綜上所述，建立的回歸方程能代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)來解釋響應(yīng)結(jié)果。

2.3.2 響應(yīng)面分析

等高線的形狀反映交互效應(yīng)的強(qiáng)弱大小，圓形表示兩因素交互作用不顯著，而橢圓形則表示兩因素交互作用顯著[19]。圖7、8可知，液料比與超聲功率(AD)、超聲時(shí)間與超聲功率(BD)的交互作用對(duì)黃粉蟲黃酮的提取量影響顯著。同時(shí)，由兩組圖可知，在所選范圍內(nèi)存在極值點(diǎn)，即響應(yīng)面最高點(diǎn)，也是等高線最小橢圓的中心點(diǎn)(5點(diǎn))。

圖 7 液料比和超聲功率交互作用對(duì)黃酮提取量的影響Fig.7 Response surface and contour plots showing the effect of liquidto-solid ratio and ultrasonic power on the yield of fl avonoids

圖 8 超聲時(shí)間和超聲功率交互作用對(duì)黃酮提取量的影響Fig.8 Response surface and contour plots showing the effect of ultrasonic treatment time and power on the yield of fl avonoids

圖7表示超聲時(shí)間為30min，浸提溫度為50℃時(shí)，液料比與超聲功率對(duì)黃酮提取量的影響。當(dāng)超聲功率一定時(shí)，黃酮提取量隨液料比增大先增大后減小，當(dāng)液料比小于18：1(mL/g)時(shí)，黃酮提取量逐漸增大；當(dāng)液料比一定是，黃酮提取量隨超聲功率的增加而增大，當(dāng)大于380W時(shí)，趨于緩和。

圖8表示液料比20：1(mL/g)，超聲溫度50℃時(shí)，超聲時(shí)間和超聲功率對(duì)黃酮提取量的影響。當(dāng)超聲功率一定時(shí)，黃酮提取量隨超聲時(shí)間的延長(zhǎng)先增大后逐漸減小，在超聲時(shí)間為30min之前，黃酮提取量逐漸增加；當(dāng)超聲時(shí)間一定時(shí)，黃酮提取量隨超聲功率的增加而增大，當(dāng)功率達(dá)380W時(shí)，趨于緩和。

由Design-Expert 7.0 Trial軟件分析可知，超聲波輔助提取黃粉蟲黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)為液料比18.34：1(mL/g)、超聲時(shí)間30.06min、浸提溫度58.43℃、超聲功率380.62W，在此優(yōu)化條件下，黃粉蟲黃酮提取量的理論值11.58mg/g。結(jié)合實(shí)際試驗(yàn)條件，最終選擇的實(shí)驗(yàn)條件為液料比18：1(mL/g)、超聲時(shí)間30min、浸提溫度58℃、超聲功率380W。經(jīng)驗(yàn)證，得實(shí)際測(cè)得黃粉蟲黃酮提取量為11.47mg/g，與理論值基本一致，說明該方程與實(shí)際情況擬合很好，證明應(yīng)用響應(yīng)面優(yōu)化條件來提高黃粉蟲黃酮提取量的方法可行。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)采用響應(yīng)面法對(duì)超聲波水提取黃粉蟲黃酮工藝進(jìn)行優(yōu)化，建立的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型具有良好的顯著性。提取黃粉蟲黃酮的最佳工藝條件為液料比18.34：1(mL/g)、超聲時(shí)間31.06min、浸提溫度58.43℃、超聲功率380.62W，理論預(yù)測(cè)值為11.58mg/g，實(shí)際測(cè)量值為11.47mg/g。4種因素的影響大小依次為超聲時(shí)間、超聲功率、液料比、浸提溫度。超聲波水提取黃粉蟲黃酮，降低了生產(chǎn)成本，是一種安全、經(jīng)濟(jì)和高效的提取方法。

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