響應面設計法優化不同基源貝母中總生物堿的提取工藝

徐 彥，劉 圓，呂露陽，曾 銳，張志鋒*

(西南民族大學少數民族藥物研究所，四川 成都 610041)

貝母為百合科貝母屬多種植物的干燥鱗莖，具有止咳化痰、清熱散結之功效。在民間常常用于制作具有保健作用的藥膳食用，如川貝冰糖湯、川貝釀梨、貝母燉豬肺等。貝母在我國分布較廣，《中國藥典》(2010版)收載了川貝母、浙貝母、湖北貝母、新疆貝母、平貝母等5個品種，近年來也有一些新種被發現[1]。貝母的主要成分為生物堿，生物堿不僅具有明顯的鎮咳作用[2-5],而且有其他多方面的藥理活性[2-4]。生物堿的含量常作為貝母類藥物的指標成分，其測定方法有比色法、兩相滴定法、非水滴定法、薄層色譜法、反相離子對高效液相色譜法等[5]。

近年來對于貝母總堿提取工藝的報道[6-9]中，大多是對單一品種多采用乙醇滲漉提取或乙醇回流提取，然后用氯仿進行萃取，然而通過這些方法提取的貝母總堿操作較為復雜、收率較低，并且目前尚未有關于多種不同來源的貝母在同一提取條件下進行總生物堿的比較研究報道。因此本研究考慮到氯仿對生物堿的溶解度比乙醇更大，而甲醇提取比乙醇提取的雜質更少，選擇氯仿-甲醇的混合溶劑提取，通過單因素試驗和響應面設計試驗，以提取溶劑比例、液料比、提取時間等作為提取工藝考察因素，優化貝母總生物堿的提取工藝，得出最佳提取條件。作者收集了不同產地、不同基源的貝母，在優化的最佳提取條件下提取貝母總生物堿，以貝母乙素為對照品，用酸性染料比色法測定其總生物堿的含量。

1 材料與方法

1.1 材料、儀器與試劑

川貝母、平貝母、新疆貝母、湖北貝母和浙貝母的鱗莖，經筆者鑒定。貝母總生物堿提取工藝優化試驗中所用的貝母材料為川貝母。貝母素乙 中國食品藥品檢定研究院；氯仿、甲醇、溴麝香草酚藍等均為分析純。

METTLER AE240電子分析天平 梅特勒-托利多儀器有限公司；W201B恒溫水浴鍋 上海申順生物科技有限公司；Unicam UV-500紫外-分光光度儀 美國賽默飛世爾科技公司。

1.2 方法

1.2.1 貝母總生物堿的制備

將貝母鱗莖粉末在50℃恒溫烘干至恒質量，精密稱取粉末0.5g置于50mL圓底燒瓶中，加入適量氨水浸泡，浸泡一段時間后加入氯仿-甲醇混合溶劑，水浴加熱回流提取，按照單因素考察和響應面設計表設定的條件進行提取，過濾，揮干溶劑，用甲醇定容至25mL，靜置待測。

1.2.2 吸收波長的選擇

精密吸取樣品溶液1mL，置分液漏斗中，加氯仿14mL，鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液緩沖液(pH5.0)5mL，溴麝香草酚藍溶液2mL，充分振搖，靜置0.5h使充分分層，取下層氯仿液，用干燥濾紙濾過，取濾液，在200～600nm波長范圍內進行紫外吸收掃描。同時取貝母素乙對照液0.5mL，同上法測定，隨行空白測定。結果顯示，標準品溶液和樣品溶液的最大吸收出現在(415±1)nm處，故選415nm處為貝母總生物堿的測定波長。

1.2.3 標準曲線的繪制

貝母素乙標準品溶液的配制：精密稱取貝母素乙對照品5.0mg，用甲醇溶解定容至10mL，即得質量濃度0.5mg/mL標準品溶液。

精密吸取上述述貝母素乙標準溶液母液2.5mL，用甲醇定容于25mL容量瓶，制成質量濃度為0.05mg/mL的標準液，再分別吸取1.0、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、5.0mL，按照1.2.2節所述的顯色方法顯色后，在415nm波長處進行紫外吸收度測定，以吸光度(Y)為縱坐標、貝母素乙質量濃度(X/(mg/mL))為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程：Y＝4.5262X－0.0777，R2＝0.9996。結果表明，貝母素乙標準品質量濃度在0.05～0.25mg/mL范圍內與吸光度呈良好線性關系。

1.2.4 貝母總生物堿的測定

精密吸取樣品溶液1mL，按1.2.2節中的測定方法測定其吸光度，重復3次，取其平均值為最終吸光度。根據測得的吸光度，計算出其相應的質量濃度，得貝母總堿的計算公式如下：

式中：C為貝母總生物堿的質量濃度/(mg/mL)；V為提取液定容體積/mL；m為貝母粉末質量/g。

1.2.5 單因素試驗

將貝母粉末過60目篩，選擇2倍體積量的氨水浸泡1h，20倍體積混合溶劑(氯仿：甲醇＝4：1，V/V)，70℃水浴提取4h，提取1次，經顯色后測定其吸光度，以吸光度為指標比較提取效果。固定其他條件，分別考察考察粉碎粒徑、氨水浸泡量和浸泡時間、氯仿和甲醇的體積比和用量(液料比)、提取時間、提取次數作為貝母鱗莖總生物堿提取過程的影響[9-11]。

1.2.6 響應面設計試驗

從單因素試驗結果分析可知，氯仿和甲醇的體積比、液料比和提取時間對提取效果的影響比較大，故在單因素試驗的優化結果上，以貝母總生物堿的得率為指標，在選定貝母粉碎粒徑為60目，2倍體積的氨水浸泡，浸泡時間2h、提取溫度70℃、提取次數2次的前提下，根據Box-Behnken模型進行響應面試驗，選取混合溶劑(氯仿：甲醇)的比例(A)、液料比(B)、提取時間(C)為自變量，試驗因素及水平設計見表1。

表 1 響應面法分析因素及水平Table 1 Factors and their coded levels used in response surface analysis

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 貝母鱗莖粉碎粒徑的影響

圖 1 粉碎粒徑對貝母鱗莖總生物堿提取效果的影響Fig.1 Effect of raw material particle size on the extraction effi ciency of total alkaloids

從圖1可知，粉碎粒徑在20～60目范圍內，提取效果隨粉碎粒徑的減小而提高，而在過80目篩后提取效果反而隨著粒徑的減小而降低，原因可能是粉碎粒徑太小導致原料表面張力增加，不利于有效成分的溶出。故選貝母粉末過60目篩為宜。

2.1.2 氨水浸泡量的影響

圖 2 氨水浸泡量對貝母鱗莖總生物堿提取效果的影響Fig.2 Effect of ammonia water volume used to immerse Bulbus Fritillariae on the extraction effi ciency of total alkaloids

由圖2可知，當氨水浸泡量與貝母粉末質量比為2∶1(mL/g)時，提取效果最好，之后隨著氨水量的增加，提取效果反而下降，故選2倍體積的氨水浸泡貝母粉末為宜。

2.1.3 氨水浸泡時間的影響

圖 3 氨水浸泡時間對貝母鱗莖總生物堿提取效果的影響Fig.3 Effect of immersion time on the extraction effi ciency of total alkaloids

由圖3可知，在氨水浸泡1～2h期間溶液的吸光度增大，在2h后吸光度降低，因此選氨水浸泡2h為宜。

2.1.4 氯仿和甲醇體積比的影響

圖 4 氯仿和甲醇體積比對貝母鱗莖總生物堿提取效果的影響Fig.4 Effect of CHCl3/CH3OH ratio on the extraction effi ciency of total alkaloids

由圖4可知，氯仿和甲醇體積比在1∶1、2∶1、4∶1的范圍內，隨著氯仿比例的增加，溶液的吸光度也隨之增加，當氯仿的比例繼續增大時，溶液的吸光度又隨之減小，故混合溶劑比率選擇氯仿∶甲醇為4∶1為宜。

2.1.5 液料比的影響

圖 5 液料比對貝母鱗莖總生物堿提取效果的影響Fig.5 Effect of ratio of Bulbus Fritillariae to CHCl3:CH3OH on the extraction effi ciency of total alkaloids

由圖5可知，隨著提取溶劑量的增大，提取效率也隨之增加，到液料比為30∶1(mL/g)時，提取效率不再增加，而略有所降。其原因是溶劑量增多時，溶劑與材料的接觸越充分，溶出率越大，當達到一定量時，貝母總生物堿的溶出已基本飽和，為節約成本及減小后續處理難度，故選擇液料比為30∶1為宜。

2.1.6 提取溫度的影響

圖 6 提取溫度對貝母鱗莖總生物堿提取效果的影響Fig.6 Effect of temperature on the extraction effi ciency of total alkaloids

由圖6可知，在30～70℃范圍，提取效率呈上升趨勢。溫度的升高有助于傳質過程，使分子擴散運動激烈，加速貝母堿在溶液的擴散和提取溶劑的滲透，同時提取液黏度隨溫度升高而降低，加速貝母堿的溶出。然而，由于氯仿沸點61.7℃、甲醇沸點64.5℃，因此，當水浴溫度超過65℃以后，將不會增加其提取效果，本實驗結果也證實，當水浴溫度大于70℃后，提取明顯效率下降。故水浴溫度控制在約65℃，溶液沸騰即可。

2.1.7 提取時間的影響

由圖7可知，提取時間4h之前，提取效果呈上升趨勢，當繼續延長提取時間時，貝母堿的提取效果有下降趨勢，可能是因為貝母堿在溶液中浸提時間過長，結構被破壞而導致貝母堿提取率減少，故選提取時間4h為宜。

圖 7 提取時間對貝母鱗莖總生物堿提取效果的影響Fig.7 Effect of extraction time on the extraction effi ciency of total alkaloids

2.1.8 提取次數的影響

圖 8 提取次數對貝母鱗莖總生物堿提取效果的影響Fig.8 Effect of number of extractions on the extraction effi ciency of total alkaloids

從圖8可以看出，提取2次貝母堿的提取率比提取1次的明顯提高，增加提取次數到3次時，提取率略有增加。從降低成本和節約時間角度出發，故選提取2次為宜。

2.2 響應面設計試驗結果與分析[12-13]

2.2.1 模型的建立及顯著性檢驗

表 2 響應面分析方案及試驗結果Table 2 Box-Benhnken experimental design and results

在單因素試驗基礎上，采用響應面設計試驗對貝母堿的提取工藝進一步優化，Box-Behnken試驗設計與結果如表2所示，試驗1～12為析因試驗，13～17為中心試驗。

采用Design-Exper 7.0軟件對響應值與各因素進行回歸擬合，得到回歸方程Y＝2.83＋0.075A－0.025B＋0.057C＋5.0×10-3AB＋0.17AC＋0.15BC－0.32A2－0.90B2－0.39C2。模型系數顯著性結果和方差分析結果見表3。

表 3 回歸統計分析表Table 3 Analysis of variance for the fifi tted regression model

由表3表明，氯仿和甲醇的體積比一次項、提取時間一次項、混合溶劑比例和提取時間的交互項、液料比和提取時間的交互項、混合溶劑的比例二次項、液料比二次項、提取時間二次項達到極顯著水平(P＜0.01)。液料比一次項達到顯著水平(P＜0.05)。混合溶劑比例和液料比的交互項不顯著。由表3的F值的大小可判斷各因素對貝母總生物堿提取率的影響程度的大小次序為C＞A＞B，即提取時間＞氯仿和甲醇體積比＞液料比。

2.2.2 最佳提取工藝條件的優化

由Design-Exper 7.0軟件的嶺脊分析得到貝母總生物堿最佳提取工藝條件，即氯仿：甲醇4.14：1、液料比29.95：1、提取時間4.1h，在此條件下提取貝母總生物堿，含量可達2.84mg/g。為檢驗響應面法所得的結果的可靠性，采用上述優化條件進行貝母總生物堿的提取，考慮到實際操作的便利，將最佳提取條件修正為氯仿：甲醇4.2：1、液料比30：1、提取時間4h，重復3次實驗，結果得出貝母總生物堿的含量的2.84mg/g，與理論預測值相符。因此，該方程能較真實地反映各因素對貝母總生物堿提取效果的影響情況。

2.3 貝母總生物堿的含量測定

依照最終優化的提取工藝，對不同產地、不同種類的貝母進行總生物堿的提取，測定吸光度，根據1.2.3節標準曲線回歸方程計算總生物堿的含量，結果見表4。

表 4 不同基源貝母總生物堿的含量Table 4 Extraction effifi ciency of total alkaloids bulbs from different Fritillaria species

由表4可以看出，這幾種貝母中，湖北貝母的總生物堿含量最高，其次為川貝母、浙貝母、平貝母、新疆貝母總生物堿含量差異較小[14-15]。

3 結 論

3.1 本實驗通過單因素試驗以及響應面試驗優化出了貝母總生物堿的最佳提取工藝為：貝母鱗莖粉末過60目藥典篩，2倍體積的氨水浸泡2h，混合溶劑氯仿-甲醇的體積比為4.2：1、液料比30：1、水浴回流提取4h、提取2次。在此條件下，所用四川松潘川貝母的總生物堿含量2.84mg/g，與響應面模型的預測值基本相符，說明該優化條件可靠。

3.2 在優化條件下對收集的不同基源貝母進行總生物堿的提取和含量測定，得出湖北貝母的總生物堿含量最高，其次為川貝母、浙貝母、平貝母、新疆貝母。本研究選擇的混合溶劑(氯仿-甲醇溶液)提取貝母總結，減少文獻研究中的因萃取步驟帶來的含量損失。

3.3 響應面分析法由于試驗次數少，試驗精度高，并適合于多因素、多水平的試驗，并可研究因素間的交互作用，根據綜合指標得到最優的工藝結果，比正交設計試驗法更簡化，比均勻設計更全面，且得到的關系式可以確定在試驗范圍內的任何試驗點的預測值，是用于優化和考察工藝條件的首選方法。

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