響應面法優化枸杞葉粗多糖提取純化工藝及其降血糖活性

江 磊，梅麗娟，劉增根，李潔瓊，王啟蘭，邵 赟，陶燕鐸,*

(1.中國科學院西北高原生物研究所，青海 西寧 810008；2.中國科學院大學，北京 100049)

糖尿病是一種臨床表現為高血糖的系統性疾病，它的直接引發原因是胰島素分泌不足，這種病會引起體內糖類、蛋白質和脂類代謝紊亂[1]。在糖尿病患者中，90%的病人都屬于Ⅱ型糖尿病。患這種糖尿病的病人群體數量有擴張趨勢，這種病給家庭和社會帶來了沉重的經濟負擔[2]。持續性高血糖可以引起體內非酶反應的蛋白糖基化，從而在臨床上表現為糖尿病的復雜病理特征[3]。控制餐后血糖就變成了治療糖尿病過程中的一個重點[4]。在哺乳動物體內，淀粉的消化主要在小腸內，首先由α-淀粉酶將長鏈淀粉分子消化為直鏈或支鏈的低聚麥芽糖，然后由α-糖苷酶將這些低聚糖消化為葡萄糖[5]。因而抑制α-糖苷酶活性就成了控制餐后血糖的關鍵[6]。

枸杞葉俗稱天精草，《本草綱目》中稱枸杞葉“有除煩益志補五勞七傷、壯心氣、除熱毒、散瘡腫、除風明目”之功效。據研究，枸杞葉的活性成分與枸杞果實基本一致，而且在某些營養元素上甚至超過枸杞果實[7]。據報道枸杞多糖具有減輕Ⅱ型糖尿病小鼠胰島素抵抗[8]，誘導樹突狀細胞成熟和增強T細胞增殖[9]，增強人外周血巨噬細胞的免疫功能[10]，治療胃潰瘍[11]，保護血管內皮細胞[12]和抑制人食管癌細胞Eca-109的生長增殖[13]等生理功效。枸杞葉多糖可能和枸杞多糖一樣具有這些功效。為了研究枸杞葉多糖的藥用價值，其提取純化方法變得至關重要。本實驗采用響應面法對枸杞粗多糖的提取工藝進行優化，利用大孔樹脂和DEAE弱陰離子交換柱對枸杞葉粗多糖進行了純化，用α-D-吡喃葡萄糖苷(p-NPG)的方法測定了枸杞葉精多糖對α-糖苷酶的抑制活性，從而估計枸杞葉精多糖的降血糖活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

取25℃條件下陰干的枸杞葉，于60～80℃烘干2h，經粉碎、干燥至質量恒定后備用。

p-NPG、α-糖苷酶(E.C.3.2.1.20) 美國Sigma 公司。DEAE-52陰離子交換柱柱料 美國Amresco公司；D101大孔樹脂 天津南大樹脂科技有限公司。苯酚、濃硫酸等均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1800型紫外-可見光分光光度計 日本島津公司；HH-6恒溫水浴鍋 鄭州杜甫儀器廠；AE240S型電子分析天平 德國梅特勒-托利多公司；Model 680酶標儀 美國Bio-Rad公司。

1.3 多糖含量的測定

準確稱取100mg葡萄糖，以去離子水溶解并定容至100mL，精確量取葡萄糖標準工作液(1mg/mL)0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，分別置于試管中，各加去離子水使成2mL，各管中葡萄糖的質量濃度分別為0.05、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50mg/mL。吸取上述各管中的葡萄糖溶液0.6mL至于干凈試管中，加6%苯酚試劑1.2mL搖勻。迅速滴加濃硫酸6.0mL，并迅速搖勻。靜置5min，沸水浴15min取出。流動水冷卻至室溫。另以0.6mL去離子水同樣操作，作空白對照，在490nm波長處測定吸光度。以葡萄糖質量濃度C為橫坐標、吸光度A為縱坐標，制作標準曲線并得其回歸方程為A＝9.75C－1.09(R2＝0.9995)。

多糖含量的測定參考方崇波等[14]的方法稍作修改。精密稱取一定質量的枸杞葉粗多糖樣品，測定吸光度后計算葡萄糖質量濃度后，按照下式計算枸杞葉粗多糖樣品中多糖的含量：

式中：C1為葡萄糖的質量濃度；V是樣品溶液總體積；m為樣品總質量；D為樣品稀釋倍數。

1.4 基本提取工藝流程

枸杞葉粗多糖制備的基本工藝流程：陰干的枸杞葉經粉碎后過100目篩→熱水浸漬提取→離心取上清液(4000r/min，10min)→乙醇沉淀→離心取沉淀(4000r/min，10min)→乙醇洗滌→干燥溶劑→枸杞葉粗多糖。

1.5 單因素試驗

設定溫度70℃、浸提時間2h、料液比(枸杞葉粗粉與水質量比)1：50，固定其他條件分別考察料液比(1：30、1：40、1：50、1：60)、浸提溫度(60、70、80、90℃)、浸提時間(l、2、3、4h)對枸杞葉粗多糖得率的影響。

1.6 響應面法對工藝進行優化

利用響應面法，對水解條件進行優化。以多糖含量作為響應值，試驗因素及水平見表1。

表 1 水解工藝的試驗因素編碼表Table 1 Independent variables and their coded levels used in response surface analysis

1.7 枸杞葉粗多糖的純化

首先將枸杞葉陰干粉碎，于90℃純水中浸漬5h，離心取上清液并加入無水乙醇使最終醇體積分數達到85%后于常溫沉淀2h。將沉淀用無水乙醇洗滌2次，干燥后得到枸杞葉粗多糖。最后將枸杞葉粗多糖于4℃保存待用。

將上述干燥的枸杞葉粗多糖小心溶于去離子水中，并將此多糖溶液通過已處理的D101大孔樹脂柱，流速10mL/min。再用去離子水以相同的流速用3倍柱體積的流量進行洗柱。小極性雜質均吸附在大孔樹脂上，去離子水洗脫下的組分即為第一步純化后的枸杞葉多糖溶液。將此多糖溶液冷凍干燥后于4℃保存待用。

將第1步純化中多糖凍干粉用去離子水溶解，溶解時應注意要盡可能的增加溶液的濃度。將多糖溶液通過已用去離子水平衡的DEAE-52柱分離，流速 0.15mL/min。在進行洗脫時流速為1mL/min，首先用3倍柱體積的去離子水洗柱，除去不能吸附的雜質，然后用1.0mol/L的NaCl溶液進行洗脫。將洗脫液透析除鹽后冷凍干燥即為純化后的枸杞葉精多糖(PO)，于4℃保存待用。

1.8 PO的α-糖苷酶抑制活性測定

1.8.1 樣品溶液的制備

首先配制2mg/mL的PO溶液，用去離子水稀釋成0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1mg/mL。陽性對照藥阿卡波糖配成1.0mg/mL。

1.8.2 α-糖苷酶抑制活力的測定

參考康文藝等[15]的方法稍作修改。將5U的α-糖苷酶溶于50mmol/L的pH7.4的磷酸緩沖液中定容至1mL制成酶液。將待測樣品精確稱取10mg定溶于1mL相同的磷酸緩沖液中制成樣品溶液。取1mL相同的磷酸緩沖液用作空白對照。首先在96孔板中加入酶液20μL和樣品液40μL，37℃水浴10min。然后用排槍快速加入60μL的20mmol/L的P-NPG溶液，37℃水浴10min。反應結束后，立即用排槍快速加入0.2mol/L Na2CO3(160μL/孔)。將96孔板置于酶標儀上用405nm波長進行檢測，α-糖苷酶活性抑制率計算公式如下：

式中：A0為空白的吸光度；A1為樣品吸光度。

1.9 統計與分析

本實驗采用SAS 9.1軟件對實驗結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 料液比對多糖含量的影響

圖 1 料液比對枸杞葉多糖含量的影響Fig.1 Effect of solid-to-solvent ratio on polysaccharides content of crude extracts

由圖l可知，料液比在1：30～1：40范圍內，枸杞葉粗多糖含量迅速上升，從6.57%上升到6.82%，增加了2.50%。但是在1：40～1：60范圍內，枸杞葉粗多糖含量上升緩慢，增加了0.09%。從實際生產成本綜合考慮，選取1：30、1：40和1：50三個水平進行響應面試驗。

2.1.2 提取溫度對多糖含量的影響

圖 2 提取溫度對多糖含量的影響Fig.2 Effect of temperature on polysaccharides content of crude extracts

提取溫度為60℃時，多糖含量為6.64%；提取溫度為80℃時，多糖含量迅速上升到6.71%；當提取溫度從80℃上升到90℃時，多糖含量增加緩慢，提高了0.08%，因此選擇提取溫度水平60、70℃和80℃進行響應面試驗。

2.1.3 提取時間對多糖含量的影響

提取時間為1h時，多糖含量較低，為6.47%；當浸提時間為2h時，多糖含量有較大幅度的提高，為6.63%。提取時間為3h和4h時，多糖含量分別為6.85%和6.91%。但3h后上升緩慢，因此選擇1、2h和3h進行響應面試驗。

圖 3 提取時間對粗多糖含量的影響Fig.3 Effect of time on polysaccharides content of crude extracts

2.2 響應面試驗

表 2 響應面設計及響應值Table 2 Experimental design and results for response surface analysis

應用SAS 9.1統計軟件對響應面試驗結果(表2)進行多元二次回歸分析，將極不顯著的項(X3)剔除之后，可以得到回歸方程：

表 3 回歸分析表Table 3 Analysis of variance for the fi tted regression model

如表3所示，對回歸方程的各因子和總體進行方差分析，結果表明各應變量與全體自變量多元回歸關系顯著，因此可以用回歸值代替真實值對實驗進行研究。

圖 4 各因素交互作用對多糖含量的響應面圖Fig.4 Response surface plots for the effect of extraction parameters on polysaccharides content of crude extracts

如圖4A所示，在一定范圍內，多糖含量隨料液比和提取溫度的升高而升高，顯出極顯著的交互作用關系，圖4B和4C同樣可以觀察到。隨著溫度的升高，多糖分子內能增加，分子運動加劇，溶解性增強；而溫度過高會破壞多糖分子，促進雜質溶入，造成最后樣品中多糖含量偏低。因此溫度只能控制在一個合適的范圍內。如果料液比太大，溶劑溶解多糖的能力有限，會造成多糖含量低；而料液比太小又會使許多雜質成分溶入提取液中，也會造成多糖含量低。因此料液比也只能控制在一個合適的范圍內。提取時間過長，會促進雜質成分的溶入，而提取時間太短會降低多糖分子溶解量，因此提取時間也只能控制在一個合適的范圍內。

根據圖4觀察最佳水解條件近似為：料液比1：50、溫度70℃、時間2h。為了得到準確的工藝條件，將多元二次方程兩邊分別對X1、X2、X3做一階偏微分，對方程組的一階偏導取值為零，得到方程組：

解得最優條件為X1＝0.1458、X2＝0.1298、X3＝0.1194，即：料液比1：47.2、溫度72.9℃、時間2.2h。

2.3 對最優提取工藝的驗證實驗

利用2.2節中得到的最佳提取工藝參數，料液比1：47.2、溫度72.9℃、時間2.2h，平行進行5次實際提取實驗，得到的多糖含量為(7.24±0.41)%，與模型值7.36%相近，再次驗證了回歸模型的正確性。

2.4 α-糖苷酶抑制活性的測定

經苯酚硫酸法檢驗，純化后多糖含量為92.5%(后文中的枸杞葉多糖指的是提純后的枸杞葉多糖)。將純化后的多糖用于α-糖苷酶活性的檢測，結果如圖5所示，枸杞葉多糖在質量濃度范圍0.3～0.7mg/mL范圍內對α-糖苷酶的抑制活力表現出強烈的質量濃度依賴性，在質量濃度大于0.8mg/mL時進入平臺期，抑制活力隨抑制劑質量濃度增大變化不大。這表明PO具有抑制糖吸收的功能，具有降糖的功效。由表4可知，在相同質量濃度1mg/mL下，枸杞葉多糖的抑制率達93.7%，而阿卡波糖(Acarbose)僅為21.7%。枸杞葉多糖對α-糖苷酶半數抑制率IC50＝0.51mg/mL。

圖 5 PO的抑制率隨質量濃度變化的關系Fig.5 Relationship of α-glycosidase inhibitory activity and concentration of purifi ed polysaccharides

表 4 空白、陽性藥物、PO對α-糖苷酶的抑制率比較Table 4 Comparison of α-glycosidase inhibitory activity of acarbose and purifi ed polysaccharides

3 結 論

采用熱水浸提法提取枸杞葉粗多糖，其工藝參數用響應面法進行優化，得到的回歸方程的R2＝0.9942，說明擬合方程可以很好地描述實際值。優化的工藝參數結果為：料液比1：47.2、溫度72.9℃、時間2.2h，此條件下多糖含量為(7.24±0.41)%，工藝驗證實驗表明最大工藝條件可靠。采用大孔樹脂和DEAE陰離子交換樹脂對枸杞葉多糖進行純化，純化后含量升至92.5%。用純化后的多糖進行α-糖苷酶抑制劑活性檢測，結果表明枸杞葉精多糖是一種很好的α-糖苷酶抑制劑，其IC50＝0.51mg/mL。

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