大豆轉基因檢測中DNA提取方法的比較研究

劉 欣，祝長青,，王毅謙，沈 赟，黃 明,*，蔣 原，周光宏

(1.南京農業大學食品科技學院，國家肉品質量安全控制工程技術研究中心，江蘇 南京 210095；2.江蘇出入境檢驗檢疫局，江蘇 南京 210001；3.江蘇疾病預防控制中心，江蘇 南京 210009)

大豆是我國乃至全世界重要的經濟與糧食作物，是食用油和植物蛋白最豐富、最廉價的來源。為了提高大豆的產量，滿足人們對大豆的需求量，科研人員采用基因工程與分子輔助育種方法，培育了一些高產、優質和抗逆以及適合農場機械化種植的轉基因大豆品種。2010年國際農業生物技術應用服務組織(International Service for the Acquisition of Agri-biotech Applications，ISAAA)的數據顯示：2010年轉基因大豆仍然是最主要的轉基因作物，種植面積約7330萬公頃，占全球轉基因作物種植面積的50%左右。中國從上世紀末開始進口耐除草劑轉基因大豆，各種與轉基因大豆相關的產品越來越多地進入市場[1]。目前，對于轉基因食品的安全性存在很多爭議，各國先后制定了有關轉基因食品檢測、標識以及管理的各項措施[2-3]。為保障廣大消費者的知情權和選擇權，滿足國際貿易的需要，建立準確、快速、高效的轉基因成分檢測技術至關重要。核酸檢測技術，尤其是常規聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)和實時熒光PCR法，已經被廣泛應用于食品生物安全檢驗等多個領域[4-5]，成為目前成熟的主流基因檢測平臺。核酸檢測的關鍵因素是提取到高質量的DNA[6]。不同植物材料的DNA提取方法各異，但是總體思路都是先用去污劑將細胞膜及核膜破裂，然后用化學藥劑將蛋白質及多糖沉淀去除，最后沉淀純化DNA[7]。大豆材料中因含有較多的蛋白和脂類，其DNA提取的難度較大[6]。提取大豆DNA常使用SDS法提取大豆幼嫩葉片的DNA，獲得的大豆DNA質量較高，但是需要耗費大量的時間與精力將大豆培養至幼苗期[8]，難以應用于實際轉基因大豆的檢測。轉基因大豆檢測與進出口大豆檢測常從大豆子粒中提取DNA，這樣可以節省植物幼苗的培育時間。國內外學者、生物公司也在大豆子粒DNA提取上進行研究，開發了一些基于SDS和CTAB的大豆子粒DNA提取方法[9-10]以及相關試劑盒。

本研究以大豆子粒為材料，比較Bayer、DuPont、Monsanto公司提供的3種大豆DNA提取方法以及國際上使用較多的商品化Qiagen試劑盒法、國內廣泛使用的Tiangen試劑盒法，通過紫外分光光度法、瓊脂糖凝膠電泳法、實時熒光PCR法分析5種方法提取的大豆DNA質量，優選出合適的大豆DNA提取方法，以實現對轉基因大豆進行快速、準確檢測，滿足我國國內以及進出口農產品與食品中轉基因檢測與標識的法規需要。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆子粒由江蘇出入境檢驗檢疫局動植物與食品檢測中心提供，用Vorwerk攪拌器研磨成細粉，用于DNA提取。

植物基因組DNA提取試劑盒(目錄號：69106) 德國Qiagen公司；植物基因組DNA提取試劑盒(目錄號：DP320-02) 北京Tiangen公司；λ DNA/Hind Ⅲ Marker、Proteinase K、RNase A 日本Takara公司；瓊脂糖 基因科技(上海)有限公司；熒光PCR擴增試劑LightCycler 480 Probes Master預混液 瑞士Roche公司；大豆凝集素基因(lectin)引物 上海輝睿生物技術有限公司；其他化學試劑均為分析純。

1.2 儀器與設備

攪拌器 德國Vorwerk公司；雜交爐 德國GFL公司；J-E冷凍離心機 美國Beckman公司；Centrifuge 5417C微型離心機 德國Eppendorf公司；MB-102恒溫振蕩金屬浴 日本Bioer公司；C130-1230V 手掌離心機 美國Labnet公司；NanoDrop 1000 微量紫外-分光光度計 美國Thermo公司；AQE-183-2 全自動凝膠成像系統 英國Syngene公司；LightCycler 480Ⅱ實時熒光PCR擴增儀 瑞士Roche公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取方法

1.3.1.1 Bayer公司的方法[11]

取2g大豆粉末放入50mL離心管中，加入10mL提取緩沖液，加入0.7mL 20% SDS，混勻后60℃溫育30min，期間不斷晃動。待材料冷卻至室溫后8000×g離心5min，吸取1mL上清液至新的離心管中，按比例調整各試劑用量，用氯仿代替苯酚，進行DNA提取，最后用100μL 0.2×TE緩沖液溶解DNA。

1.3.1.2 DuPont公司的方法[12]

取2g大豆粉末放入50mL離心管中，加入10mL十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)裂解緩沖液和20μL Proteinase K (20mg/mL)，混勻后60℃溫育2h，期間不斷晃動。待材料冷卻至室溫后8000×g離心5min，吸取1mL上清液至新的離心管中，用氯仿代替苯酚，進行DNA提取，最后用100μL 0.2×TE緩沖液溶解DNA。

1.3.1.3 Monsanto公司的方法[13]

取2g大豆粉末放入50mL離心管中，加入10mL溶液，包括9.8mL事先加熱的CTAB裂解緩沖液、0.2mL β-巰基乙醇和50μL Proteinase K(20mg/mL)，混勻后60℃溫育1h，期間不斷振搖。待材料冷卻至室溫后8000×g離心5min，吸取1mL上清液至新的離心管中，按比例調整各試劑用量，用氯仿代替苯酚，進行DNA提取，最后用100μL 0.2×TE緩沖液溶解DNA。

1.3.1.4 Qiagen試劑盒提取方法

取2g大豆粉末放入50mL離心管中，加入10mL AP1溶液和30μL Proteinase K(20mg/mL)，混勻后60℃溫育1h，期間不斷晃動。待材料冷卻至室溫后8000×g離心5min，吸取500μL上清液至新的離心管中，根據試劑盒說明進行DNA提取，最后用100μL AE緩沖液洗脫。

1.3.1.5 Tiangen試劑盒提取方法

取2g大豆粉末放入50mL離心管中，加入6mL LP1溶液和50μL Proteinase K(20mg/mL)，混勻后60℃溫育30min，期間不斷晃動。待材料冷卻至室溫后8000×g離心5min，吸取400μL上清液至新的離心管中，根據試劑盒說明進行DNA提取，最后用100μL TE緩沖液洗脫。

1.3.2 DNA純度、得率的檢測

用NanoDrop1000微量紫外-分光光度計測定樣品液的純度及質量濃度。DNA的純度取決于A260/A280、A260/A230的大小；DNA質量濃度由DNA模板在260nm波長處的吸光度決定，A260=1時DNA質量濃度為50ng/μL[14]。DNA得率用q測驗進行多重比較，DNA得率根據下式計算：

1.3.3 DNA分子質量和完整性的檢測

用1×TAE溶液配制1%的瓊脂糖凝膠，EB染料加入瓊脂糖凝膠中。取10μL DNA溶液與2μL 6×Loading Buffer混合后點樣。然后在80V恒定電壓條件下進行電泳，電泳時間60min。電泳結束后，將瓊脂糖凝膠塊置于凝膠成像系統中，觀察、拍攝電泳圖譜并進行分析。

1.3.4 DNA用于實時熒光PCR擴增的適應性檢測

取DNA溶液以及相應的10倍稀釋液作為模板，對大豆內源基因lectin進行實時熒光PCR擴增，并設置空白對照。根據國家標準GB/T 19495.5—2004《轉基因產品檢測：核酸定量PCR方法》合成lectin基因特異性的引物和探針見表1。優化的反應體系見表2，DNA樣品的10倍稀釋液與原液加入相同的體積進行實時熒光PCR反應。優化后反應條件為：預變性95℃反應10min，1個循環體系為95℃反應15s，59℃反應1min同時收集熒光，共進行55個循環。

表 1 設計的引物、探針Table 1 Primers and probe of real-time fluorescent PCR amplification of lectin

表 2 lectin基因的TaqMan實時熒光PCR反應體系Table 2 Reaction system of real-time fluorescent PCR amplification of lectin

2 結果與分析

2.1 5種提取方法的DNA純度與得率

表 3 5種方法提取大豆DNA純度、得率比較Table 3 Purity and yield of DNA from soybean with five methods

上述5種提取方法均能從大豆中提取出DNA，但由表3可知，提取效果有明顯差異。由每種方法重復2次所得數據的平均值，對大豆子粒而言，采用Bayer法、Monsanto法提取DNA的A260/A280、A260/A230均較小，表明存在蛋白質、多糖、鹽等雜質，所提取的DNA純度不高；采用DuPont法提取的DNA的A260/A280接近1.7，A260/A230＜2.0，表明所提取的DNA去除蛋白質效果較好但是仍有蛋白質殘留，并且存在多糖、鹽等雜質；Tiangen試劑盒法提取DNA的A260/A280在1.7～1.9之間，A260/A230＜2.0，表明所提取的DNA中殘存多糖、鹽和小分子雜質等；采用Qiagen試劑盒法提取的DNA的A260/A280＞1.9，A260/A230＞2.0，表明DNA樣品中有RNA。就DNA得率而言，Bayer法的DNA得率顯著高于其他4種方法(P＜0.05)，Qiagen試劑盒法的DNA得率顯著高于Tiangen試劑盒法、DuPont法與Monsanto法(P＜0.05)，Tiangen試劑盒法與DuPont法的DNA得率差異不顯著(P＞0.05)，Monsanto法的DNA得率最低，且與其他方法差異顯著(P＜0.05)。綜合考慮DNA純度與得率，Qiagen試劑盒法、Tiangen試劑盒法與DuPont法效果較好，Monsanto法與Bayer法效果較差。

2.2 5種提取方法的DNA完整性

圖 1 5種方法提取的DNA凝膠電泳結果Fig.1 Agarose gel electrophoresis analysis of DNA with five methods

DNA樣品瓊脂糖凝膠電泳圖譜見圖1。Bayer法、DuPont法、Qiagen試劑盒法、Tiangen試劑盒法均可提取出DNA，其片段大于23kb，RNA降解較為完全，提取得到的DNA完整性較好。從圖1還可以看出，雖然電泳上樣量相同，但DNA條帶亮度有較大區別：Bayer法提取的DNA樣品，通過260nm時的吸光度計算，判斷其得率最高，但在電泳時發現其DNA條帶亮度較低、點樣孔較亮且主帶下方有拖帶現象，說明在樣品中存在蛋白質、多糖等雜質的污染；DuPont法、Qiagen試劑盒法、Tiangen試劑盒法提取的DNA條帶明亮；Monsanto法提取出DNA經電泳未觀察到明顯的條帶。因此，DuPont法、Qiagen試劑盒法、Tiangen試劑盒法提取的DNA純度高、產率高、完整性好。

2.3 大豆lectin基因的實時熒光PCR擴增

以5種方法提取的DNA樣液與其10倍稀釋液取等體積液體作為DNA擴增模板，對大豆內源基因lectin進行實時熒光PCR擴增，結果見圖2。

圖 2 DNA與其10倍稀釋液的lectin基因的擴增結果Fig.2 Fluorescent PCR amplification of lectin using DNA and 10-fold dilution as template

由圖2可知，除了以Monsanto法提取的DNA為模板的擴增沒有特征圖譜外，Bayer法、DuPont法、Qiagen試劑盒法與Tiangen試劑盒法提取的DNA與其10倍稀釋液為模板擴增均得到典型的擴增對數圖譜，說明使用Monsanto法提取大豆的DNA不適合進行實時熒光PCR。

對數圖譜反映的是熒光量的對數與PCR循環次數的關系，指數擴增階段PCR產物隨循環數指數增長且擴增效率穩定，熒光量等比例增長[15]，因此指數擴增階段熒光量的對數隨循環數呈線性增加，其斜率與擴增效率正相關。由圖2A可見，Bayer法提取的DNA在指數擴增階段時熒光量對數的增長明顯較10倍稀釋液的平緩，說明Bayer法提取得到的DNA進行實時熒光PCR的擴增效率較10倍稀釋液的低，故使用Bayer法提取得到的DNA中存在雜質，抑制實時熒光PCR的擴增；由圖2B、2D與2E可見，DuPont法、Qiagen試劑盒法和Tiangen試劑盒法提取的DNA與其10倍稀釋液的擴增曲線的指數增長期的平行性良好，說明使用DuPont法、Qiagen試劑盒法、Tiangen試劑盒方法提取得到的DNA無明顯抑制實時熒光PCR擴增的雜質存在。

3 討論與結論

本實驗以大豆子粒為材料，研究Bayer、DuPont、Monsanto公司提供的3種大豆DNA提取方法以及國外的Qiagen試劑盒法、國內的Tiangen試劑盒法提取DNA的效果，旨在優選出簡便、快速、有效的大豆DNA 提取方法。根據檢測工作的實際需要，各方法使用2g大豆粉作為DNA提取樣品，以保證抽取樣品具有較好的代表性。由于大豆粉樣品用量的增加，Qiagen和Tiangen試劑盒法增加蛋白酶用于去除過多的蛋白以減少干擾。此外，Bayer法、DuPont法、Monsanto法使用氯仿代替苯酚進行抽提去除雜質，避免苯酚殘留使DNA降解以及對后續PCR所造成的抑制[16]。

Bayer法使用SDS使染色體離析、蛋白質變性，并與蛋白質和多糖結合成復合物沉淀，釋放出DNA，DNA得率最高，但是DNA純度最差，表明用SDS提取DNA時會吸附較多雜質，這與張偉等[17]的研究結果類似。DuPont和Monsanto法均使用CTAB陽離子去污劑使蛋白質變性，并與蛋白質和多糖形成復合物，釋放DNA，瓊脂糖凝膠電泳圖譜顯示DNA較完整，但是兩種方法在DNA純度與得率上存在較大差異：DuPont法通過氯仿抽提、鹽溶液的濃度變化去除雜質，能提取到較高質量的DNA，與Mafra等[18]的研究結果相似；Monsanto法與王振東等[19]的方法相比，氯仿抽提次數少、多次使用醇類沉淀DNA，造成提取到的DNA雜質含量多且損失過多，因此純度差且得率最低，不過此方法可取之處是裂解緩沖液中加入抗氧化劑β-巰基乙醇，能防止酚氧化成醌，避免褐變，使酚容易去除[16]。Qiagen試劑盒法使用雜質去除離心柱與核酸吸附離心柱來提取純化DNA，Tiangen試劑盒法使用核酸吸附離心柱提取DNA，兩種方法均能提取到較高質量的DNA。因此DuPont法、Qiagen試劑盒法與Tiangen試劑盒法能夠提取到純度好、得率高、完整性較好的DNA。

核酸檢測技術中實時熒光PCR技術具有敏感性高、特異性強的優點，已經成為應用范圍最廣泛并且成熟的轉基因檢測平臺[20]。試驗中取DNA溶液以及相應的10倍稀釋液作為模板，對大豆內源基因lectin進行實時熒光PCR擴增，檢驗DNA對實時熒光PCR的適應性。結果表明：Monsanto法提取的DNA得率過低不能得到很好的擴增；Bayer法、DuPont法、Qiagen試劑盒法與Tiangen試劑盒法提取的DNA均能擴增出目的片段，但是Bayer法提取的DNA含有較多的實時熒光PCR抑制劑，如多糖、酚類等，影響實時熒光PCR結果準確性。因此，DuPont法、Qiagen試劑盒法與Tiangen試劑盒法提取的DNA能夠用于實時熒光PCR檢測。

轉基因大豆的實際檢測工作中，要求DNA提取方法經濟、簡單、快捷。Bayer法耗時至少8h，DuPont法需要5h左右，Monsanto法需要7h左右，DuPont法用時短、步驟簡便，比起另外兩種方法更適合在實際檢測工作中應用。試劑盒法均用時短，1～2h內便可完成DNA提取工作，但是需要一定的成本支出，Qiagen試劑盒平均提取一個樣品DNA花費40元，成本過高，不適合在我國大范圍推廣；Tiangen試劑盒平均提取一個樣品DNA花費10元，具有較高的性價比，適用于實際檢測工作。

綜上所述，5種方法中DuPont法和Tiangen試劑盒法所提取的DNA純度好、得率高、完整性較好，含有較少抑制因子，幾乎對實時熒光PCR的檢測無影響，且操作簡便、性價比較高，適用于大豆DNA提取。其中Tiangen試劑盒法用時較短，但成本稍高。在實際檢測工作中，應根據檢測任務的緊急情況和成本，有針對性地選擇合適的大豆DNA提取方法。

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