UPLC-MS/MS分析橘汁發酵液中檸檬苦素的變化趨勢

江 海，李新生,*，吳三橋，張志健，劉 新，韓 豪，高 玥，彭 浩，胥彥明

(1.陜西理工學院生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2.陜西省資源生物重點實驗室，陜西 漢中 723000；3.陜西城固酒業有限公司，陜西 城固 723200)

柑橘是世界第一大水果，世界柑橘常年總產量6000～10000萬t。分布于全球140個國家和地區，其中柑橘產量居世界前3位的分別為巴西、美國、中國[1-3]。我國柑橘經濟栽培區主要集中在北緯20～33°之間，海拔700～1000m以下的亞熱帶、熱帶地區，年栽培面積133～200萬公頃之間，占世界栽培面積的20%，其中長江上中游柑橘帶、贛南-湘南-桂北柑橘帶、浙南-閩西-粵東柑橘帶為我國柑橘優勢栽培區[4]。2007年，我國柑橘種值面積和產量均居世界首位[5]，主要包括日南1號、宮川、山下紅、大浦、興津等100多個品中。其中寬皮橘類占80%以上，多集中于11—12月上市。世界柑橘加工率約為40%，主要加工產品年產量大約為1860×104t，分別為柑橘汁、橘瓣罐頭，以及柑橘糖制品果醬、果凍和蜜餞[6-7]。而我國柑橘的加工率不足10%，鮮食量超過90%。

隨著柑橘栽培面積的擴大，加之品種結構不合理，柑橘上市集中，國內缺乏大型柑橘加工企業等原因，目前國內柑橘產業常常出現“豐產不豐收”，柑橘滯銷，橘農“賣橘難”等問題，嚴重挫傷了橘農種植積極性，在個別地方甚至出現了橘農砍伐果樹的現象。解決我國柑橘滯銷問題，最可行的辦法就是大力發展柑橘深加工。

鑒于此，本項目組開展了利用柑橘果汁發酵生產柑橘果酒的生產技術研究，但是，在柑橘果酒發酵過程中，橘子汁發酵液會出現極明顯的苦味，這成為了困擾柑橘果酒生產的難題。柑橘發酵中苦味主要來自檸檬苦素類(limonins)的作用。檸檬苦素是一種三萜類的植物次生代謝產物，廣泛存在于柑橘屬植物中，至今已從柑橘屬植物中分離出36種檸檬苦素類似物及17種檸檬苦素類似物配糖體[8-9]。據報道，檸檬苦素在水溶液中的苦味閾值約為1×10-6mol/L。有強烈苦味的檸檬苦素和諾米林酸，如果在柑橘果汁中的含量超過6mg/L，那么這種柑橘就不適合用于飲食業[10-13]。

本實驗利用超高效液相色譜-質譜(ultra performance liquid chromatograph-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS)對柑橘果酒發酵工藝中橘汁發酵液檸檬苦素進行跟蹤監測，分析橘子發酵加工產品中苦味變化趨勢，旨為柑橘果酒研制提供基礎實驗數據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

漢中主產柑橘品種宮川，經剝皮、榨汁、橘汁調節糖度后于發酵罐中發酵，取不同發酵階段和陳釀階段的液體為檢測材料[14-15]。

乙腈(色譜純) 美國Burdick and Jackson 公司；娃哈哈純凈水；甲醇(分析純) 天津市登峰化學試劑廠；檸檬苦素(純度為99.8%) 天津一方科技有限公司。

1.2 材料與儀器

ACQUITY UPLC超高效液相色譜、ACQUITY TQD三重四極桿質譜儀 美國Waters公司；水浴鍋 北京科偉永興儀器有限公司；TD24-低速臺式離心機 長沙湘儀器有限公司；AUW220D電子天平(十萬分之一)、AUY220電子天平(萬分之一) 日本島津公司；SK1200H超聲波清洗機 無錫市興邦基業電子有限公司；BM252C榨汁機 美的公司；全自動生物發酵罐(7L) 上海保興生物設備工程有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(50mm×2.5mm，1.9μm)，柱溫40℃，流速0.3mL/min，進樣5μL。流動相為：乙腈-水(A：B)梯度洗脫，乙腈(A)梯度為0～3min(10%～50%)，3～4min(50%～10%)，4～5min(10%～10%)。

1.3.2 質譜條件

毛細管電壓3.2kV，錐孔電壓40kV，離子源溫度110℃，脫溶劑氣溫度400℃，錐孔氣流量50L/h，脫溶劑氣流量800L/h。離子化模式為電噴霧離子源正離子模式(electrospray ionization，ESI+)，碰撞池電壓30V，碰撞氬氣流速0.14mL/min。采用多反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)，檸檬苦素母離子m/z 471.1，子離子m/z 425.3、161.1。

1.3.3 標準品溶液的制備

用AUW220D電子天平，精密稱取檸檬苦素標準品2.85mg，用10mL乙腈溶解，超純水定容至25.0mL。制得檸檬苦素114mg/L的標準對照母液。

1.3.4 標準曲線制備

取檸檬苦素標準母液0.05、0.1、0.5、1.0、2.0mL，用50%乙腈溶液定容于10mL容量瓶。得到含檸檬苦素0.57、1.14、5.70、11.40、22.80mg/L的標準工作溶液。在儀器設定的色譜-質譜條件下，通過0.22μm濾膜過濾，進標準梯度樣品各5μL，以檸檬苦素母離子m/z 471.1進行選擇，m/z 425.3為定性離子，m/z 161.1為定量離子。

1.3.5 定量限實驗

將含檸檬苦素0.57μg/mL的標準溶液逐級稀釋，在液相質譜分析條件下進樣分析，以RSN=10確定檸檬苦素和諾米林檢測的定量限。

1.3.6 樣品的制備

取3批橘子汁樣品各5L(總糖70.9g/L，總酸9.26g/L)做平行實驗，調節總糖質量濃度到218g/L，引入葡萄酒酵母，21℃條件下在發酵罐中主發酵7d，主發酵結束后酒精度(V/V)為12.5%～13.5%(20℃)，后導入陶罐中進行陳釀。

取主發酵時間為0、2、4、5、6、7d的發酵液和陳釀15、30、60、90、180d和360d的基酒進行分析檢測。

精密量取5.0mL橘汁發酵液于50.0mL具塞三角燒瓶中，加5.0mL乙腈，稱定燒瓶質量。超聲處理30min，稱量燒瓶質量，用乙腈補足損失質量。4000r/min離心3min，取上清液過0.22μm微孔濾膜，待測。

2 結果與分析

2.1 檸檬苦素線性的繪制

圖 1 檸檬苦素標準品色譜-質譜圖Fig.1 UPLC-MS/MS chromatogram of limonin standard

標樣色譜圖見圖1，以質量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標擬合標準工作曲線。檸檬苦素線性回歸方程為：Y=62.7883X+11.245，r=0.99954。該檢測條件下，檸檬苦素在2.85～114ng之間線性關系良好。

2.2 定量限確定

經實驗，在液相-質譜分析條件下進樣分析得到RSN=10，計算得檸檬苦素的定量檢測限為2.8ng/mL。

2.3 重復性實驗

取同一橘汁發酵液，按1.3.6節方法制備樣品，在色譜-質譜條件下平行測定5次，每次進樣5μL，測定檸檬苦素的峰面積，計算相對標準偏差。其中檸檬苦素的峰面積分別為432.1、448.2、428.5、439.8、437.6，RSD為1.73%(n=5)，結果表明方法的重復性良好。

2.4 穩定性實驗

取同一橘汁發酵液，在色譜-質譜條件下，分別在0.5、1、6、12、24h進樣5μL檢測檸檬苦素的峰面積，分別為428.7、432.2、425.6、411.8、410.6，計算相對標準偏差，求得RSD為2.36%(n=5)。結果表明在該方法條件下，檸檬苦素24h內穩定。

2.5 回收率實驗

精密量取已測定檸檬苦素為12.46mg/L的橘汁發酵液5.0mL，加入5.7mg檸檬苦素標準物質，按1.3.6節方法制備樣品條件平行制備3份，在色譜-質譜條件下測定，計算檸檬苦素的回收率，結果如表1所示。

表 1 回收率測定結果Table 1 Recovery rate of the UPLC- MS/MS method

2.6 橘子汁發酵液中檸檬苦素含量

表 2 橘汁發酵液中檸檬苦素的質量濃度Table 2 Limonin concentration in fermented orange juice

圖 2 橘汁發酵液檸檬苦素色譜-質譜圖Fig.2 UPLC-MS/MS chromatogram of limonin in fermented orange juice

橘汁發酵4d后液體中的檸檬苦素的色譜圖見圖2，平行制備3個批次的橘子汁發酵液，按1.3.6節方法進行樣品制備，在設定的儀器條件下進行檢測。橘汁中的檸檬苦素的含量分析結果見表2。

圖 3 第1(A)、2(B)、3(C)批橘汁樣品中檸檬苦素變化趨勢圖Fig.3 Changes of limonin in batch 1 (A), 2 (B) and 3 (C) of fermented orange juice

由表2顯示，橘汁在發酵過程中檸檬苦素有一個上升的過程，基本在主發酵結束時達到最高值，隨著陳釀時間的延長，檸檬苦素含量逐漸降低。檸檬苦素的變化趨勢如圖3所示。

3 討論與結論

3.1 檸檬苦素含量的測定可用于控制柑橘及其相關產品的質量。已報道的檢測方法很多, 主要有Davis法、分光光度法、薄層色譜法(thin layer chromatography，TLC)、高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)等[8,16-18]。由于檸檬苦素類似物配糖體極性強，在提取液中常與許多雜質共存，因而對其檢測及純化都很困難，多數檢測方法效果不佳。對于柑橘及其加工產品中低含量的檸檬苦素沒有辦法進行精確定量。本實驗采用的UPLC-MS/MS分析方法能夠準確的定量分析柑橘產品中的檸檬苦素，檢測限低、樣品處理簡單、重復性好，能夠用于柑橘及其相關產品中檸檬苦素含量的分析，控制相關產品質量。

3.2 通常柑橘鮮食無苦味，但經榨汁、殺菌等加工處理后就表現出苦味。從實驗結果可以看出，柑橘發酵液有一個明顯的檸檬苦素上升的過程，該現象印證了橘汁產品的“延遲苦味”。據研究，柑橘汁出現“延遲苦味”的原因主要是在酸性條件和檸檬苦素D環內酯水解酶的催化下，果實中所存在的非苦味的檸檬苦素A-環內酯轉變成了具有強烈苦味的檸堿[19]。

柑橘加工產品出現延遲苦味是柑橘加工業中比較重要的問題，避免苦味的產生或脫除橘汁中的苦味物質是提高柑橘加工產品品質的關鍵。現常見的脫苦技術有吸附法、固化霉脫苦法、生物法、β-環糊精脫苦法、分離法脫苦等[20-21]。在實驗過程中，曾采用自然沉降法，檢測苦味物質的變化。苦味物質隨時間從低到高再逐漸降低，也能達到脫苦的效果，不過耗時較長，但對于發酵生產橘子果酒，長時間的保存發酵液能增加產品的厚重感和產品特有風味。

3.3 發酵過程中發酵條件的控制也是橘汁發酵液產生苦味的一個重要原因。但無論如何控制條件，橘子汁發酵液中的檸檬苦素都有一個逐漸上升再到慢慢降低的過程，橘汁發酵液中檸檬苦素的這種變化趨勢，將指導橘子酒的生產。取不同發酵時間的發酵液勾兌得到橘子果酒，發酵時間短的橘子果酒，苦澀味明顯，消費者多不接受。360d(一年)后的發酵液勾兌的產品香味純正，具橘子特有清香、酒體橙黃、澄清透明、酸甜柔和、無明顯苦澀感，能為多數消費者接受。采用發酵保藏時間一年以上的橘汁發酵液生產橘子果酒，能獲得品質較高的橘子酒。

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