利用電子舌對富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物的脫苦評價

王佳佳，胡志和,*，趙 悅

(1.天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津 300134；2.北京盈盛恒泰科技有限責(zé)任公司，北京 100055)

牛乳不僅含有豐富的營養(yǎng)成分，提供人類豐富的必需氨基酸，而且還是生物活性肽的重要來源[1]。自Maruyama等[2]于1982年在酪蛋白水解物分離出具有ACE抑制活性的12肽(CEJ12)，各國科研人員采用不同的方法從酪蛋白中分離提取了更多具有不同降壓效果的ACE抑制肽，它與普通降壓藥物相比具有無毒副作用，且對正常的血壓沒有影響。因此，食源性降血壓肽成為抗高血壓功能食品或藥物研究的重點(diǎn)[3]。酶法水解蛋白質(zhì)可得到多種具有高ACE抑制活性的降壓肽，但在水解的同時也會相應(yīng)的有苦味肽的形成，這使得產(chǎn)品無法滿足口感和嗜好的要求從而限制了短肽在食品工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用[4-5]。在酶解過程中，往往由于條件限制，盡管底物、酶和水解度可以選擇并加以控制降低苦味，但有時也無法滿足脫苦的最低條件，還需要外加措施進(jìn)行脫苦，其方法主要包括選擇性分離法、掩蓋法、酶法等[6-7]。風(fēng)味蛋白酶不僅可以通過使風(fēng)味前體物水解釋放出風(fēng)味物質(zhì)來增強(qiáng)和改善食品的風(fēng)味，還可以通過內(nèi)切蛋白酶將苦味肽徹底降解為氨基酸。

對苦味的評價長期以來主要采用感官評定法，但其結(jié)果不夠客觀，易受環(huán)境、評價者情緒、健康狀況等的影響。作為一種能快速檢測味覺品質(zhì)的新技術(shù)，電子舌能夠以類似人的味覺感受方式(人的舌頭)檢測出味覺物質(zhì)，可以對樣品進(jìn)行味覺的量化，因而具有重復(fù)性、高靈敏性、可靠性等優(yōu)勢。由于電子舌的這些特點(diǎn)，目前該技術(shù)在飲料鑒別與區(qū)分、酒類產(chǎn)品(啤酒、清酒、白酒和紅酒)區(qū)分與品質(zhì)檢測、初級農(nóng)產(chǎn)品識別與分級、在茶葉評審中的鑒別應(yīng)用、航天醫(yī)學(xué)檢測、制藥工藝研究、環(huán)境監(jiān)測等中有較多應(yīng)用[8]。電子舌的興起就是從對食品的鑒別中發(fā)展而來的，現(xiàn)在，電子舌在食品感官品質(zhì)鑒別上的應(yīng)用研究日益增多。本實(shí)驗(yàn)采用復(fù)合風(fēng)味蛋白酶對富含ACE抑制肽的酪蛋白水解物進(jìn)行脫苦處理，并采用味覺分析系統(tǒng)(電子舌)，采用多通道型仿生脂質(zhì)膜傳感器技術(shù)對味覺進(jìn)行量化而得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 試劑

酪蛋白(酪蛋白含量≥80%) 天津海河乳業(yè)有限公司；胰蛋白酶(10000U/g)、胃蛋白酶(10000U/g) 美國Sigma公司；風(fēng)味蛋白酶(33000U/g) 丹麥Novo公司。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-2100紫外-可見分光光度計(jì) 日本Unico公司；FA1104N電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司；EMS-8A加熱磁力攪拌器 天津市歐諾儀器儀表有限公司；PB-10普及型pH計(jì) 德國Sartorius公司；Scientz-50N冷凍干燥機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；TS-5000Z型電子舌(味覺分析系統(tǒng)) 日本Insent公司。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白的雙酶水解

參照張艷等[9]確定的胃蛋白酶和胰蛋白酶水解酪蛋白的條件，對酪蛋白進(jìn)行水解。

1.3.2 風(fēng)味酶法脫苦的單因素試驗(yàn)

風(fēng)味蛋白酶是一種由篩選的未經(jīng)基因改造的米曲霉菌株經(jīng)深層發(fā)酵生產(chǎn)的蛋白酶/肽酶復(fù)合物，含有兩種活力的內(nèi)切蛋白酶和外切蛋白酶，反應(yīng)最佳溫度為50℃，最佳pH值范圍5.0～7.0，故從[E]/[S]、pH值和反應(yīng)時間3個方面進(jìn)行，固定[E]/[S]為3000U/g、pH6、酶解時間2h，改變其中一個條件，通過感官評分分別考察3個因素對水解液苦味脫除的影響。

表 1 風(fēng)味酶法脫苦單因素因素水平表Table 1 Hydrolysis parameters and levels for one-factor-at-a-time design

1.3.3 風(fēng)味酶法脫苦的正交試驗(yàn)

通過感官評分所確定的單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定三因素的取值水平范圍，進(jìn)行正交試驗(yàn)確定最佳水解條件組合。

1.3.4 苦味的評價方法

1.3.4.1 感官評定

采用感官評定的方法，將通過風(fēng)味酶水解的水解液提供給5名品嘗者，將1.3.1節(jié)方法得到酪蛋白雙酶水解液為基準(zhǔn)液，將其分別稀釋0、1、2、3、4、5、6、7、8倍，其對應(yīng)的苦味評分分別是0、1、2、3、4、5、6、7、8。根據(jù)此評分標(biāo)準(zhǔn)，品嘗復(fù)合肽溶液的苦味并與標(biāo)準(zhǔn)比較進(jìn)行評分，最后取平均值表示苦味程度。

1.3.4.2 電子舌分析

取2.5g經(jīng)冷凍干燥的風(fēng)味酶水解過的酪蛋白水解物，加入70mL的蒸餾水使其充分溶解后，倒入電子舌配備的小塑料杯中，每個約35mL作為平行，放入儀器中進(jìn)行測試。利用苦味和苦味的回味兩種傳感器獲得味覺數(shù)據(jù)結(jié)果，并通過多元回歸分析和主成分分析用圖形化方式表達(dá)出結(jié)果。

1.3.5 ACE體外檢測及IC50的確定

因?yàn)轱L(fēng)味蛋白酶對酪蛋白雙酶水解液的水解，可能會使水解液中原本的ACE抑制肽活性降低甚至喪失，所以需要對正交試驗(yàn)中選取的最好的幾個結(jié)果中，挑選出對其活性影響最小的。

1.3.5.1 ACE抑制活性的體外檢測

采用最常用的HHL方法[10-11]體外檢測ACE抑制率。具體方法如表2所示。

表 2 ACE抑制率體外檢測方法 Table 2 Procedure for detection of in vitro ACE inhibitory activity %

根據(jù)表2可知，將各試劑加入到5mL離心管中混勻(每管做3組平行)，反應(yīng)結(jié)束后加入1.7mL乙酸乙酯，經(jīng)15s振蕩、混勻后離心(4000r/min，15min，4℃)，吸取1.0mL乙酸乙酯層于試管中，在120℃的烘箱中烘干30min后，向試管中加入3mL去離子水，檢測在228nm處的吸光度，其計(jì)算公式為：

式中：A為反應(yīng)中ACE抑制劑和ACE同時存在的吸光度；B為反應(yīng)中不加抑制劑的吸光度，即對照；C為ACE和HHL空白反應(yīng)的吸光度，即空白。1.3.5.2 半數(shù)抑制濃度(IC50)的測定

稱取雙酶水解產(chǎn)物以及通過電子舌評定結(jié)果脫苦效果最好的正交試驗(yàn)試樣3、6、8、9，分別配制成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.3、0.6、1.0mg/mL的溶液，測定各溶液的ACE抑制率，并繪制ACE抑制率曲線，計(jì)算出IC50值。

2 結(jié)果與分析

2.1 風(fēng)味酶脫苦試驗(yàn)苦味評分

2.1.1 單因素試驗(yàn)的苦味評分

表 3 感官評分結(jié)果Table 3 Results of one-factor-at-a-time design for sensory evaluation of debittered casein hydrolysate

由表3可以看出，當(dāng)隨著加酶量的增加苦味評分隨之增加，當(dāng)[E]/[S]為3000U/g時水解液的苦味基本脫除，再增加加酶量苦味評分增加的不大，且隨著加入量的增加，對水解液的顏色有加深現(xiàn)象，不利于它的進(jìn)一步應(yīng)用，故這里選擇加酶量為3000U/g；在水解pH值為6.5和水解時間2.0h時，苦味評分比較好，故選擇水解pH值為6.5，水解時間2.0h，正交試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上確定因素水平范圍。

2.1.2 正交試驗(yàn)的苦味評分

表 4 感官評價法正交試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Orthogonal array design and results for sensory evaluation of debittered casein hydrolysate

由于人的感覺器官在分辨力、敏感度、穩(wěn)定性等方面的個體差異，以及極易受外界因素的干擾，故將在各條件下的水解液進(jìn)行冷凍干燥成粉末，進(jìn)行電子舌的苦味和苦味回味的檢測。

由表4極差分析可知酶解條件對風(fēng)味酶法脫苦的影響依次為酶底比＞水解時間＞水解pH值，酶底比和水解時間是影響脫苦效果的主要因素，風(fēng)味酶法脫苦的最佳處理?xiàng)l件為[E]/[S]= 3200U/g、時間1.5h、pH 6.8，在該條件下復(fù)合肽的苦味值評分為7.8，苦味基本脫除。

2.2 電子舌對風(fēng)味酶脫苦的評定

2.2.1 酶用量對脫苦效果的影響

對照組為6天1輪輸精周期，即公雞連用5天輸完3200只母雞，休1天。試驗(yàn)1組是7天1輪輸精周期，即公雞連用5天，輸完3200只母雞，休2天；實(shí)驗(yàn)2組是8天1輪輸精周期，即公雞連用5天，輸完3200只母雞，休3天。輸兩個周期后，開始收集種蛋、及時入孵、統(tǒng)計(jì)受精率，具體輸精方案見表1。

圖 1 加酶量對脫苦的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on debittering

由圖1可以看出，將電子舌的結(jié)果用二維坐標(biāo)圖表示出來，圖中橫坐標(biāo)為苦味，縱坐標(biāo)為苦味的回味，數(shù)值越大代表苦味和苦味的回味越顯著，這里將加酶量2000U/g作為零點(diǎn)，可以看出隨著加酶量的增加，水解物的苦味和苦味的回味都逐漸降低，在3500U/g時苦味和苦味的回味都最低，故加酶量為3500U/g時最好。

2.2.2 pH值對脫苦效果的影響

圖 2 pH值對脫苦的影響Fig.2 Effect of pH on debittering

由圖2可以看出，電子舌的結(jié)果通過二維坐標(biāo)圖表示出來，圖中橫坐標(biāo)為苦味，縱坐標(biāo)為苦味的回味，數(shù)值越大代表苦味和苦味的回味越顯著，其中將加酶量2000U/g為零點(diǎn)，其他的與其進(jìn)行對比，可以看出隨著pH值的增加，水解物的苦味和苦味的回味都逐漸降低，在pH值為7時苦味和苦味的回味都最低，故pH值為7時最好。

2.2.3 水解時間對脫苦效果的影響

由圖3可以看出，隨著水解時間的延長苦味消除的反而不理想，這里0.5h和1.0h無論從苦味還是苦味的回味都很好，故水解時間為0.5h最好。

圖 3 水解時間對脫苦的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on debittering

2.3 電子舌對正交試驗(yàn)的評定

電子舌法正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。

表 5 電子舌法正交試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Orthogonal array design and results for electronic tongue measurement of debittered casein hydrolysate

表 6 苦味值正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 6 Analysis of variance for debitterness value

由表6方差分析可以看出，加酶量和pH值對苦味影響都為極顯著，時間對苦味的影響為顯著，其中影響的主次因素為pH值＞加酶量＞水解時間。

表 7 苦味回味值正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析表Table 7 Analysis of variance for bitter aftertaste

由表7的方差分析可以看出加酶量、pH值、水解時間對苦味的回味都為極顯著，其中影響的主次因素為pH值＞加酶量＞水解時間。

2.4 風(fēng)味酶法脫苦對ACE抑制活性的影響

通過測定酪蛋白雙酶水解液及經(jīng)風(fēng)味酶法脫苦處理的幾個典型試樣：3、6、8、9號試樣(表4)的ACE抑制率，考察該脫苦工藝對復(fù)合肽ACE抑制活性的影響。

2.4.1 酪蛋白雙酶水解產(chǎn)物的IC50值

圖 4 酪蛋白雙酶水解產(chǎn)物質(zhì)量濃度與ACE抑制活性關(guān)系曲線Fig.4 Relationship between casein hydrolysate concentration and ACE inhibitory activity

由圖4可知，隨著樣品質(zhì)量濃度的增大，其ACE抑制率也在增大，說明ACE抑制率與樣品質(zhì)量濃度存在質(zhì)量濃度-效應(yīng)關(guān)系。通過一元二次回歸分析，得到一元二次回歸方程為y =－1.4631x2+ 2.4286x－0.0452(R2=0.991)，計(jì)算可得出酪蛋白雙酶水解產(chǎn)物的IC50值為0.27mg/mL。

2.4.2 經(jīng)風(fēng)味酶脫苦后4個典型樣的IC50值

圖 5 四個典型樣的IC50值Fig.5 IC50 of four typical samples

由圖5可知，試樣3、6、8、9的IC50值分別是0.31、0.8、0.56mg/mL和0.28mg/mL，與未經(jīng)脫苦的酪蛋白雙酶水解物的0.27mg/mL相比，試樣9不僅脫苦效果好，而且IC50值也是相對最低的，雖然風(fēng)味酶法的脫苦仍略帶苦味，但配合加糖等辦法仍具有應(yīng)用價值。

3 討 論

向含苦味的蛋白質(zhì)水解液中加入一些能掩蓋蛋白質(zhì)水解液苦味的物質(zhì)，也可使苦味減輕，如常用的食品添加劑有機(jī)酸、甜味劑等[12]，其酸味、甜味對苦味均有較好的掩蓋作用。微膠囊化包埋掩蓋法是近年來新發(fā)展的脫苦方法，它是把分散的固體物質(zhì)、液滴或氣體完全包封在一層連續(xù)薄膜中形成微小包囊的方法，使產(chǎn)品在保留營養(yǎng)的同時保持良好的感官品質(zhì)常用的是環(huán)糊精類。本實(shí)驗(yàn)曾嘗試使用環(huán)糊精脫苦如α-環(huán)糊精、β-環(huán)糊精和羥丙基-環(huán)糊精，比較得到β-環(huán)糊精的脫苦效果較好，底物質(zhì)量濃度為1g/100mL的水解物加入質(zhì)量濃度為2g/100mL的β-環(huán)糊精即可脫苦，但隨著底物濃度的增加環(huán)糊精的添加量也隨之增加，當(dāng)環(huán)糊精的質(zhì)量濃度為3g/100mL時，放置一段時間后就會有晶體的析出和一些異味反而給產(chǎn)品帶來不好的口感，故選擇風(fēng)味酶法脫苦，而風(fēng)味酶法脫苦與普通物理方法相比，通過改變苦味短肽結(jié)構(gòu)而脫苦，這勢必影響到其功能活性，為此本實(shí)驗(yàn)對經(jīng)風(fēng)味酶脫苦后的水解物，進(jìn)行了體外檢測，挑選出對活性影響最小的水解物應(yīng)用于食品中。

對蛋白短肽的苦味評價，有感官評價和儀器評價兩種方法。目前感官評定的方法仍然是最為常用、直觀和有效的方法[13]。由于感官評定法依賴經(jīng)過長期訓(xùn)練、擁有特殊味覺判別能力的品評專家來判斷，很多時候難以找到適合的人選，此外由于人的感覺器官在分辨力、敏感度、穩(wěn)定性等方面的個體差異，以及極易受外界因素的干擾[14]，儀器評價方法則避免了感官評價的不足，人類等生物活體的舌頭表面是由具有特定電勢的脂質(zhì)雙分子層膜構(gòu)成。這種電勢的變化是由于呈味物質(zhì)和脂質(zhì)之間的靜電作用或疏水作用產(chǎn)生的，變化量作為味覺信息被人的大腦所感知，是味覺評價的有效依據(jù)。而本實(shí)驗(yàn)所使用的電子舌的味覺傳感器模擬了這種生物活體的味覺感受機(jī)制，這種味覺傳感器是由人工質(zhì)膜(類似人的舌頭)構(gòu)成，它可以與各種呈味物質(zhì)之間產(chǎn)生靜電作用或疏水作用，以便于感受“味覺”。

4 結(jié) 論

利用風(fēng)味蛋白酶對富含ACE抑制肽的酪蛋白雙酶水解物進(jìn)行脫苦處理，單因素結(jié)果通過感官評定選出[E]/[S]為3000U/g、水解pH值為6.5，苦味評分比較好，與電子舌評定結(jié)果[E]/[S]為3500U/g，水解pH值為7.0脫苦效果比較來說還是比較接近的，但電子舌對時間的評定為0.5h最好與感官結(jié)果水解時間2h最好有一定的差異。通過電子舌評價結(jié)果選出脫苦效果好的正交試驗(yàn)3、6、8、9號與未經(jīng)脫苦的酪蛋白雙酶水解物進(jìn)行體外檢測比較其IC50值可得到正交試驗(yàn)中9號試樣的IC50值為0.28mg/mL與未經(jīng)脫苦的水解物IC50值為0.27mg/mL相比基本接近，故選擇正交試驗(yàn)9條件進(jìn)行處理。

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