養殖尼羅羅非魚鮮度特征及動力學模型構建

郭全友，王錫昌*，姜朝軍，張書萍，江 航，趙克儉

(1.中國水產科學研究院東海水產研究所，上海 200090；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；3.上海理工大學理學院，上海 200090)

魚類被認為是人們膳食中極有價值的蛋白質來源，因其肉味鮮美，肉質細嫩而受到人們的喜愛。羅非魚作為一種高消費量和高商業利潤的世界性養殖魚類，具有食性雜、耐低氧、不耐低高溫，繁殖強等特點，并且肉質厚、骨刺少，富含多種不飽和脂肪酸，被公認為健康食品，稱其為“21 世紀之魚”[1]。中國羅非魚產量約占世界產量的55%，絕大部分以鮮活流通為主，但運輸難、成本高，以保持低溫環境為核心要求的供應鏈系統得以應用。近年來研究者對羅非魚低溫貯藏過程質量變化和細菌種群等進行了研究，構建了特定腐敗菌(specific spoilage organisms，SSO)生長動力學模型和貨架期預測模型[2-6]。供應鏈中始終保持低溫并非易事，實際中往往脫離冷卻鏈甚至濫用溫度，夏季時魚體溫度可能達到室溫。低溫和室溫下魚類SSO差別甚大，一旦超出設定的低溫范圍，貨架期預測模型將無法使用。因此必須要選擇和測定有效的質量指標，試驗設計要覆蓋所有可能范圍的溫度條件，選擇合適的動力學模型，進而開發新的貨架期預測模型，并經過變溫和恒溫等實際流通條件的驗證。

每種水產品在給定條件下都有自身特有的優勢菌群、腐敗范圍和腐敗特征等，特別對新產品或改進型產品的腐敗菌和腐敗范圍往往還未知曉，進行相關研究可為理解腐敗現象和靶向抑制提供基礎[7-9]。溫度對貨架期的影響常用腐敗速率(rate of spoilage，RS)，即貨架期的倒數(d-1)進行測定[10-12]。研究發現雖然新鮮水產品間貨架期差異顯著，但溫度對相對腐敗速率(relative rate of spoilage，RRS)的影響具有相似性[6]，RRS模型是依據不同溫度下的貨架期來開發的，其優點是能在較大的溫度范圍內得到驗證，僅僅需要提供產品所經歷的溫度時間履歷即可，是不同溫度下貨架期計算的有效和簡單易用的工具。

本實驗通過對低溫(0～10℃)和室溫(25℃)貯藏下魚體感官、理化和微生物指標的系統研究，確定不同溫度與貨架期之間的相關性，并對貨架期預測模型的性能和適用性進行評價及驗證，旨在運用該模型和溫度時間履歷獲得0～25℃范圍內任何點處剩余貨架期信息。同時，雖然對尼羅羅非魚室低溫貯藏期間的細菌種群進行了研究[13-16]，但室溫貯藏時優勢腐敗菌的種類和腐敗力仍然未知，因此有必要對低溫和室溫下優勢腐敗菌的差異進行研究，為探究不同溫度范圍內導致產品腐敗的內在原因，為最大限度減少變質產品數量和改善消費時的品質分布，構建集動力學模型和溫度時間履歷監控于一體的高效供應鏈管理系統提供基礎。

1 材料與方法

1.1 樣品制備及貯存

尼羅羅非魚(Oreochromis niloticus)產自廣東茂名地區，鮮活運輸至上海銅川路水產批發市場等，運達試驗室后(平均體質量：450g，平均長度：240mm)冰水冷卻致死，放于高精度低溫培養箱進行低溫(0、3、5、8、10℃)、室溫(25℃)和貯藏變溫(A：0℃、136h→5℃、41h→15℃、41h→25℃、7h→8℃、48h)貯藏，貯藏期間合適間隔取樣，用溫度時間記錄儀監控溫度變化，每1h記錄一次。

1.2 試劑與儀器

營養和鐵瓊脂瓊脂培養基 上海昆蟲科技開發公司；GNID和GPID測試板 英國TREK Diagnostic Systems LTD公司；假單胞菌專用培養基 英國Oxoid公司；Sensititre微生物鑒定系統 英國Trek Diagnostic System Ltd公司；自動菌落成像分析系統、拍打式均質器、全自動微生物平皿螺旋加樣器 西班牙IUL公司；培養箱 日本Sanyo 公司；微生物鑒定系統 美國MIDI公司；175-T2時間溫度記錄儀 德國Testo公司；CX41生物顯微鏡 日本Olympus公司。

1.3 樣品處理

低溫、室溫和變溫貯藏的試驗次數(n)，見表1。每次隨機抽取3尾試樣魚，先進行生魚感官評價，然后采用GB/T 18108－2000《鮮海水魚》的取樣方法，樣品魚去鱗去內臟去腮，洗凈后沿脊骨無菌剖切，半條魚蒸熟后用于感官評價，用均質器將另半條魚肉打碎，進行菌落總數(total viable counts，TVC)、產H2S菌等計數，以及揮發性鹽基氮(total volatile basic nitrogen，TVBN)的測定。

1.4 指標測定

感官評價、TVC、假單胞菌數、產H2S菌數、TVBN和貨架期判定方法參照文獻[2-3,17]。

細菌鑒定：對整個平板或一定區域內所有菌落(通常30～100CFU)，依據菌落形態、革蘭氏染色、細胞形態，芽孢有無，運動性及氧化/發酵等特征，采用雙歧分類法進行分組，每組挑取所有菌落或若干菌落(至少2～3CFU)，分離純化25℃培養24～48h。細菌鑒定參考文獻[17-19]進行多相分類，并對優勢菌株進行16S rRNA序列進行測定，PCR產物經割膠回收后交上海生工生物工程技術服務有限公司，先進行DNA克隆，由DNA自動測序儀進行測序。

1.5 相對腐敗速率模型

平方根腐敗速率模型起初用于評價微生物的生長，亦用于評估溫度對鮮魚貨架期的影響(式(1))，RRS被定義為溫度(T/℃)的腐敗速率除以參考溫度的腐敗速率，即參考溫度時貨架期除以T時的貨架期[10]，見式(2)。

式中：k為與反應系統物質本性有關的經驗常數；T為貯藏溫度/℃；Tref為參考溫度；Tmin為理論最小溫度。

1.6 預測模型性能評價

比較模型性能(performance)最有效的手段之一是預測值和真實檢測數據進行比較，常采用決定系數(R2)、殘差平方和(residual sum of squares，RSS)、偏差度(bias factor，BF)、準確度(accuracy factor，AF)、均方根誤差(root mean square error，RMS)對模型的擬合優度(goodness of fit)進行評價[20]，即：

式(3)～(6)中：RSS表示隨機誤差的效應，用于解釋變量和隨機誤差所產生的效應；BF和AF兩者均由幾何平均值得到，偏差度用來檢查預測值的上下波動幅度，準確度用來衡量預測值和實測值之間的差異；當m=2時，RMS為均方根誤差，可有效指示模型與數據點間的均差，被廣泛用于評價模型的擬合優度。

1.7 數據處理

試驗數據用Statistica(Release 5.5)統計軟件(StsatSoft, Inc.)進行單因素方差分析及最小顯著差異法分析，當P＞0.05時差異不顯著，采用最小平方差法進行曲線擬合和評價。

2 結果與分析

2.1 0～25℃貯藏尼羅羅非魚的品質特征

表 1 低溫和室溫貯藏尼羅羅非魚品質特征和貨架期Table 1 Shelf life and quality characteristics of Oreochromis niloticus stored at low and ambient temperatures

鮮品貯藏的初始階段，品質損失主要是自溶酶等作用引起的，其后，適應貯藏環境的腐敗菌逐漸占據優勢地位，產生硫化物、有機酸、醛酮類等腐敗產物。羅非魚低溫貯藏初始感官評價良好，菌落總數、假單胞菌、產H2S菌和TVBN分別為(4.41±1.13)、(3.39±1.09)、(2.01±0.88)(lg(CFU/g))和(8.53±0.73)mg/100g。低溫(0～10℃)貯藏時貨架期終點時菌落總數、假單胞菌、產H2S菌和TVBN分別為(7.79±0.35)、(7.24±0.45)、(6.35±0.23)(lg(CFU/g))和(19.90±2.10)mg/100g，無顯著性差異(P＞0.05)。表1顯示，室溫貯藏時的貨架期終點假單胞菌數處在較低水平(5.92±0.02)(lg(CFU/g))，TVBN為(24.07±0.39)mg/100g，室溫下的假單胞菌數明顯低于低溫下的數量，而產H2S菌數高于低溫時的數量，表明室溫和低溫過程參與腐敗的細菌種類可能較大存在差異，因此，采用雙歧法、數值法和16S rRNA測序法對細菌菌群進行分類鑒定。

2.2 0～25℃貯藏尼羅羅非魚的細菌種群

表 2 低溫和室溫貯藏尼羅羅非魚貨架期終點細菌種群組成Table 2 Flora compositions of cultivated Oreochromis niloticus stored at low and ambient temperatures at the end of shelf life

表2所示，貨架期終點時，從0～10℃冷藏樣品中共分離獲得255株細菌，從25℃室溫貯藏樣品中分離到84株菌，第1～9組依次為假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、腐敗希瓦氏菌(Shewanella putrefaciens)、不動細菌屬(Acinetobacter spp.)、氣單胞菌屬(Aeromonas spp.)、水生黃桿菌(Flavobacterium aquatlis)、嗜麥芽窄食單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、嗜冷桿菌屬(Psychrobacter spp.)、棒狀菌屬(Corynebacterium spp)、沃氏葡萄球菌(Staphylococcus warneri)。低溫貯藏羅非魚貨架期終點時假單胞菌占主導地位(表2)，255株菌中有147株鑒別為假單胞菌，該菌為運動性的革蘭氏陰性桿菌，過氧化氫酶和氧化酶陽性，不產生H2S和三甲胺，也出現了一定比例的腐敗希瓦氏菌(10.2%)、嗜冷桿菌(11.4%)和少量的氣單胞菌(8.6%)。氣單胞菌是室溫(25℃)貯藏羅非魚的優勢腐敗菌，84株菌中有69株鑒定為氣單胞菌，比例為82.1%，該菌具有單鞭毛，有動力，為發酵型革蘭氏陰性菌，其中30株產生H2S，39株不產生H2S，對其腐敗力的差異有待進一步研究。

2.3 溫度特征與相對腐敗速率

依據表1中數據，利用式(1)、(2)可推導出0～25℃條件下的RS和RRS，以0℃為參考溫度，對0、5、10℃和25℃的RRS平方根數據進行擬合，見圖1，得到R R S=(1+0.1 1 T)2(式(7))，R2=0.9 8 5 9，可推導出Tmin=－8.9℃。采用BF、AF、RRS和RMS對方程7性能進行評價，由表3可知，準確度=1.10，說明預計值和實際值之間的平均差異為10%；偏差1.0表示預計值沒有系統錯誤，0.75～1.25被認為是可靠的[20]，依據方程3可知偏差度為1.10，表示預計值的偏差為10%，處在0.75～1.25范圍內，因此該模型是可靠的。

圖 1 尼羅羅非魚平方根相對腐敗速率與溫度相關性Fig.1 Typical linear relationship for Oreochromis niloticus between square root of RRS and temperatures

表 3 平方根RRS模型的預測與評價Table 3 Assessment and prediction of square root RRS model

2.4 恒溫和變溫條件下貨架期預測模型驗證

依據式(7)，以0℃作為參考溫度，推導出恒溫下的貨架期預測模型(式(8))。在生產和流通中溫度變化通常是隨機的，因此沒有數學表達式可以用來描述時間-溫度變化，剩余貨架期預測方法是把時間-溫度歷史分割成假設為很短的溫度時間區間，利用式(8)，把所經歷不同溫度下的時間(storage time，ST)累計為參考溫度下的時間，求出與參考溫度下的貨架期之差，進而可以導出變溫下的剩余貨架期(式(9))。表4所示，利用式(8)、(9)，3、8℃恒溫和變溫(A：0℃、136h→5℃、41h→15℃、41h→25℃、7h→8℃、48h)的貨架期的預測值分別為11.2、5.6d和9.1d，預測值與實測值相對誤差分別為－13.8～－4.2%，表明該模型能較好預測恒溫和變溫下貨架期。

表 4 恒溫和變溫下尼羅羅非魚貨架期預測模型驗證Table 4 Validation on predicted shelf life of Oreochromis niloticus under isothermal and non-isothermal conditions

3 結 論

3.1 通過對低溫(0～10℃)和室溫(25℃)貯藏尼羅羅非魚的感官、TVBN、TVC、假單胞菌數、產H2S菌數和細菌菌相等分析，確定低溫下貨架期為5.5～20.1d，優勢腐敗菌為腐假單胞菌，室溫下貨架期僅1.3d，優勢腐敗菌為氣單胞菌。

3.2 采用Square-Root模型確定了不同溫度下的相對腐敗速率等，得到最小溫度為－8.9℃，開發出羅非魚平方根腐敗速率模型，并采用R2、RSS、BF、AF和RMS對模型的擬合優度進行評價，結果顯示平方根預測模型具有較好的預測性能。

3.3 構建了0～25℃范圍內的貨架期和剩余貨架期預測模型，用3、8℃恒溫和變溫下的貨架期進行驗證，相對誤差為－13.8%～－4.2%，顯示平方根貨架期模型的預測性能良好，在恒溫和變溫等實際流通鏈中具有實用性。

[1] 慧芝, 車斌, 陳國平. 中國羅非魚出口現狀及應對措施[J]. 山西農業科學, 2010, 38(8)： 81-83.

[2] 許鐘, 楊憲時, 郭全友, 等. 波動溫度下羅非魚特定腐敗菌生長動力學模型和貨架期預測[J]. 微生物學報, 2005, 45(5)： 798-801.

[3] 許鐘, 楊憲時, 肖琳琳. 低溫貯藏羅非魚微生物學質量變化特性和保藏期[J]. 中國海洋大學學報, 2005, 35(4)： 621-625.

[4] 李來好, 彭城宇, 岑劍偉, 等. 冰溫氣調貯藏對羅非魚片品質的影響[J]. 食品科學, 2009, 30(24)： 439-443.

[5] GRAM L, WEDELL N, HUSS H H. The bacterial of fresh and spoilage lake victorian nile perch (Lates niloticus)[J]. Int J Food Microbiol, 1990, 10： 303-316.

[6] GRAM L, HUSS H H. Microbiological spoilage of fish and fish products[J]. International Journal of Food Microbiology, 1996, 33(1)： 121-137.

[7] MEJLHOLM O, DALGAARD P. Antimicrobial effect of essential oils on the seafood spoilage microorganism Photobacterium phosphoreum in liquid media and in fish products[J]. Lett Appl Microbiol, 2002, 34(1)： 27-31.

[8] BIRTE F V, KASTHURI V, MASATAKA S, et al. Identification of Shewanella baltica as the most important H2S-producing species during iced storage of Danish marine fish[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2005, 71(11)： 6689-6697.

[9] HERNONDEZ M D, LOPEZ M B, ALVAREZ A, et al. Sensory, physical, chemical and microbiological changes in aquacultured meagre (Argyrosomus regius) fillets during ice storage[J]. Food Chemistry, 2009, 114(1)： 237-245.

[10] DALGAARD P, JORGENSEN L V. Cooked and brined shrimps packed in modified atmosphere have shelf life over 7 months at 0℃, but spoil in 4-6 days at 25 ℃[J]. International Journal of Food Science and Technology, 2000, 35(4)： 431-442.

[11] MEJLHOLM O，KJELDGAARD J，MODBERG A，et al. Microbial changes and growth of Listeria monocytogenes during storage of brined shrimp (Pandalus borealis)[J]. Int J Food Microbiol, 2008, 124： 250-259.

[12] 郭全友, 王錫昌, 楊憲時, 等. 不同貯藏溫度下養殖大黃魚貨架期預測模型的構建[J]. 農業工程學報, 2012, 28(10)： 267-273.

[13] HUSS H H. Quality and quality changes in fresh fish[M]. USA, Rome： Food and Agriculture Organization (FAO) of the United Nations, 1995： 348.

[14] 楊憲時, 郭全友, 許鐘. 羅非魚冷藏過程細菌種群的變化[J]. 中國水產科學, 2008, 15(6)： 1050-1056.

[15] 郭全友, 許鐘, 楊憲時. 冷藏羅非魚特定腐敗菌的鑒定和生長動力學[J]. 漁業科學進展, 2009, 30(4)： 117-123.

[16] 郭全友, 楊憲時, 許鐘. 冷藏羅非魚優勢腐敗菌的鑒定及其特征[J]. 食品與機械, 2009, 25(3)： 87-90.

[17] 郭全友, 楊憲時, 許鐘, 等. 冷藏養殖大黃魚細菌相組成和優勢腐敗菌鑒定[J]. 水產學報, 2006, 30(6)： 824-830.

[18] 東秀珠, 蔡妙英. 常見細菌系統鑒定手冊[M]. 北京： 科學出版社, 2001.

[19] 須山三千三, 鴻巢章二. 水産食品學[M]. 東京： 恒星社厚生閣, 1987： 111-118.

[20] ROSS T. Indices for performance evaluation of predictive models in food microbiology[J]. Journal of Applied Microbiology, 1996, 81(5)： 501-508.