貯藏溫度對紅肉臍橙(Citrus sinensis Osbeck)果實類胡蘿卜素含量的影響

王長鋒，陶能國*，黃師榮

(湘潭大學化工學院，湖南 湘潭 411105)

果實色澤是柑橘的主要外觀品質，隨著人們生活水平的提高，果實色澤已悄然成為消費者判斷果品接受與否或者物有所值的重要參考[1]。類胡蘿卜素是絕大多數柑橘品種的著色物質，其合成受品種、成熟度、采收期、貯藏方式、貯藏條件和環境因素等的綜合影響[2-5]。醫學研究表明，柑橘果實類胡蘿卜素還具有清除人體有害自由基、增強人體免疫力、預防心血管疾病、防癌抗癌和預防維生素A缺乏癥等功能[6]。因此，柑橘果實類胡蘿卜素代謝已逐漸引起人們的濃厚興趣。

紅肉臍橙(Citrus sinensis Osbeck)是華盛頓臍橙的天然芽變，是迄今世界上唯一果肉因含番茄紅素和β-胡蘿卜素而著色粉紅的臍橙品種，20世紀80年代發現于委內瑞拉，1990年由華中農業大學柑橘研究所從美國引種至我國，在湖北、湖南、浙江、江西和福建等我國柑橘主產區均有一定面積的栽培[1,7-8]。此外，紅肉臍橙果實還含大量的線性類胡蘿卜素(如八氫番茄紅素等)，加之果實類胡蘿卜素代謝途徑未產生突變，因而成為研究柑橘果實類胡蘿卜素代謝的理想材料[9-11]。

本研究擬以紅肉臍橙為材料，探討常溫和低溫貯藏對柑橘果皮和果肉類胡蘿卜素含量的影響，以期為通過調節貯藏溫度改善柑橘果實色澤品質提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅肉臍橙(C. sinensis Osbeck)果實取自華中農業大學柑橘研究所，果實于2009年12月26日采收。低溫貯藏的樣品直接放置于4℃恒溫保鮮柜，常溫處理的樣品則置于20℃培養箱中保存，每80個果實為1小區，3次重復。從采收當天開始，每隔1周收集果皮和果肉，冷凍干燥后用液氮研磨成粉末備用。

甲醇、乙腈、MTBE(色譜純) 美國Fisher公司；正己烷、丙酮、無水乙醇、氯化鈉、氫氧化鉀(分析純) 湖南師大化學試劑廠；番茄紅素、β-胡蘿卜素標準品 美國Sigma公司；β-隱黃素、葉黃素、反式紫黃質、八氫番茄紅素、花藥黃質、α-胡蘿卜素標準品 瑞士Carote Nature公司。

1.2 儀器與設備

Thermo 706超低溫冰箱、FS60超聲波振蕩儀 美國Thermo Fisher Scientific公司；J-20XP離心機 美國Beckman公司；5301真空濃縮儀 德國Eppendorf公司；Direct-Q3超純水制備設備 法國Millipore公司；U-2800紫外可見分光光度計 日本Hitachi公司；1525高效液相色譜儀 美國Waters公司。

1.3 類胡蘿卜素提取

類胡蘿卜素的提取參考Lee[7]方法稍有改進。分別稱取0.5g左右果皮和果肉干樣，加15mL提取劑(正己烷：丙酮：無水酒精＝2：1：1，V/V，含0.1‰ BHT)，超聲波萃取30min后4000×g離心10min，沉淀用15mL提取劑重復提取2次至無色。合并上清液，用飽和NaCl水溶液反復洗3次至中性，吸取上層液，用正己烷定容至20mL，將上層液旋轉蒸發至干，溶于2mL甲基叔丁基醚(MTBE)(含0.1‰ BHT)，再加2mL 10% KOH-甲醇溶液避光條件下皂化10h。加4mL飽和NaCl水溶液和2mL MTBE(含0.1‰ BHT)使之更好的分層，洗走水層，再加3次5mL飽和NaCl水溶液洗至中性。將上清液旋轉蒸發后用1mL MTBE(含0.1‰ BHT)溶解定容備用。

1.4 類胡蘿卜素的HPLC分析

HPLC分析條件：2996PDA檢測器，YMCC30色譜柱；流動相：A：乙腈：甲醇=3：1 (含0.0l% BHT，0.05% TEA)，B：100% MTBE(含0.01% BHT)；流速為lmL/min；上樣體積為20μL，檢測波長設定為450nm。梯度洗脫：0min，A：B(95：5)；0～10min，A：B(95：5)；10～19min，A：B(86：14)；19～29min，A：B(75：25)；29～54min，A：B(50：50)；54～66min，A：B(26：74)；67min，A：B(95：5)。

Empower軟件控制及數據處理系統處理色譜結果。各組分含量以μg/g干質量(μg/g DW)表示，總類胡蘿卜素含量以各鑒定組分的含量之和計算。番茄紅素、β-胡蘿卜素、β-隱黃素、葉黃素、反式紫黃質、八氫番茄紅素、花藥黃質和α-胡蘿卜素含量根據相應的標準曲線計算；α-隱黃素和順式紫黃質的含量參照β-隱黃素和反式紫黃質的標準曲線計算。

1.5 數據分析

每組有3次重復，采用常規的分析方法來標注標準偏差，數據分析采用SPSS16.0統計分析軟件，ANOVA來分析顯著性差異(P＜0.05)。

2 結果與分析

2.1 紅肉臍橙果實類胡蘿卜素的組成

采用反相高效液相色譜(reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC)技術，根據組分保留時間，比較標準品以及PDA檢測器檢測出的波譜特點，并參照前人文獻[7,12]，初步鑒定了紅肉臍橙果皮和果肉中類胡蘿卜素的各種組分(表1)。紅肉臍橙果皮共鑒定組分15個，分別為反式紫黃質、順式紫黃質、花藥黃質、葉黃素、八氫番茄紅素、玉米黃素、β-隱黃素、ζ-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素和β-胡蘿卜素等；紅肉臍橙果肉類胡蘿卜素共鑒定出組分16個，分別為反式紫黃質、順式紫黃質、花藥黃質、葉黃素、α-隱黃素、八氫番茄紅素、玉米黃素、β-隱黃素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、番茄紅素順式異構體和番茄紅素等。

表 1 紅肉臍橙果實類胡蘿卜素組分的色譜和光譜特點Table 1 Chromatographic and spectral characteristics of the identifed carotenoids in ‘Cara Cara’ fruit

2.2 貯藏溫度對紅肉臍橙果皮類胡蘿卜素組分的影響

從圖1可以看出，貯藏的前5周內，常溫有利于紅肉臍橙果皮總類胡蘿卜素和各類胡蘿卜素組分的積累，隨著貯藏時間延長，這種優勢逐漸被低溫取代。常溫條件下，紅肉臍橙果皮總類胡蘿卜素和各組分含量呈現出現一個逐步上升的趨勢，這種趨勢隨著貯藏時間的延長而減弱直至含量降低，且不同組分出現含量高峰的時間差別較大。其中，總類胡蘿卜素、八氫番茄紅素、β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、花藥黃質、反式紫黃質、順式紫黃質于采后3周達到高峰，含量分別為(464.70±45.37)、(212.88±25.28)、(3.73±0.57)、(2.39±0.35)、(10.48±1.91)、(59.99±3.99)和(159.42±9.66)μg/g(以干質量計，下同)；而玉米黃素和β-隱黃素的含量高峰則出現在采后第1周，含量分別為(1.39±0.18)μg/g和(14.15±2.83)μg/g；葉黃素的含量甚微，勉強能檢測到。常溫貯藏6周后，紅肉臍橙果皮總類胡蘿卜素和各類胡蘿卜素含量基本保持穩定。對低溫貯藏而言，紅肉臍橙果皮總類胡蘿卜素和各類胡蘿卜素組分含量隨貯藏時間延長逐漸增加。總類胡蘿卜素、八氫番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-隱黃素、反式紫黃質和順式紫黃質含量于采后第9周達到峰值，分別為(327.18±58.59)、(123.63±19.43)、(1.78±0.20)、(42.45±6.45)、(28.47±6.48)μg/g和(120.64±23.69)μg/g；葉黃素、β-胡蘿卜素、玉米黃素和花藥黃質的峰值出現在采后第6周，含量分別為(1.11±0.22)、(1.91±0.13)、(1.60±0.19)μg/g和(5.10±0.54)μg/g；隨著貯藏時間的延長，總類胡蘿卜素和各組分含量基本保持不變。

圖 1 貯藏溫度對紅肉臍橙果皮類胡蘿卜素含量影響Fig.1 Effect of storage temperature on carotenoid contents

2.3 貯藏溫度對紅肉臍橙果肉類胡蘿卜素組分的影響

圖 2 貯藏溫度對紅肉臍橙果肉類胡蘿卜素含量影響Fig.2 Effect of storage temperature on carotenoid contents

從圖2可以看出：低溫有利于紅肉臍橙果肉類胡蘿卜素的積累。低溫貯藏條件下，紅肉臍橙果肉總類胡蘿卜素、八氫番茄紅素、番茄紅素、α-胡蘿卜素、β-胡蘿卜素、β-隱黃素和葉黃素于采后第1周達到峰值，含量分別為(278.00±21.85)、(125.03±7.23)、(185.33±14.57)、(0.40±0.04)、(11.79±2.63)、(5.11±1.03)μg/g和(3.98±0.90)μg/g，且含量顯著高于常溫貯藏(P＜0.05)，隨著貯藏時間延長，上述組分含量基本保持穩定。常溫條件下，紅肉臍橙果肉β-胡蘿卜素、α-胡蘿卜素、α-隱黃素、β-隱黃素和葉黃素含量緩慢上升，貯藏10周時達到峰值(24.56±2.56)、(0.55±0.03)、(3.71±0.05)、(3.55±0.21) 和(5.55±0.07)μg/g，隨后下降至采收時水平；番茄紅素含量于采后第3周達到峰值(105.88±14.03)μg/g，隨后逐漸下降，至第11周時顯著低于采收時含量。常溫和低溫貯藏的紅肉臍橙果肉花藥黃質含量變化趨勢類似，貯藏3周時達到峰值(4.49±0.63)μg/g和(5.35±0.31)μg/g，且兩者間含量無顯著差異(P＞0.05)，隨后逐漸降低。常溫貯藏的紅肉臍橙果肉順式紫黃質和反式紫黃質出現兩個小高峰，分別為貯藏第1周和第10周；而低溫貯藏的紅肉臍橙果肉順式紫黃質和反式紫黃質兩個高峰出現的時間則分別為第5周和第10周。

3 討 論

溫度是柑橘果實采后貯藏條件中對果實品質影響最大的環境因子[13]。類胡蘿卜素對溫度極其敏感，偏離最佳著色溫度1℃都可以對果實著色產生顯著影響[14]。對柑橘果實色澤而言，15～25℃的溫度有利于果皮黃色類胡蘿卜素的積累，但柑橘果肉中類胡蘿卜素的含量基本保持穩定[15-17]。

本研究也表明，采后紅肉臍橙果皮和果肉類胡蘿卜素的代謝存在明顯差別。常溫(20℃)不僅促進紅肉臍橙果皮玉米黃素和紫黃質的積累，而且還能促進八氫番茄紅素等線性類胡蘿卜素的積累，從而使總類胡蘿卜素含量增加。這一結果與前人關于常溫(20℃)通常有利于溫州蜜柑黃色類胡蘿卜素(如β-胡蘿卜素、β-隱黃素、玉米黃素和紫黃質)的積累，促進柑橘果實著色的報道相似[16]。奇怪的是，紅肉臍橙果皮β-隱黃素在貯藏1周時少量增加，隨后保持較穩定的水平，隨著貯藏時間延長至5周后又逐漸下降，顯著低于采收時的含量(P＜0.05)。出現這一現象可能與品種特性有關。Van Wyk等[18]研究發現， 20℃能導致Palmer臍橙果皮著色品質下降。常溫貯藏的紅肉臍橙果肉除β-胡蘿卜素、葉黃素，α-隱黃素含量于采后第10周急劇上升外，其余類胡蘿卜素含量只在貯藏前1周內小幅增加，隨后保持較為穩定的水平。

與前人報道類似[16]，在貯藏初期，低溫(4℃)能基本保持紅肉臍橙果皮總類胡蘿卜素和各組分的含量，但隨著貯藏時間的延長，各組分呈現緩慢增加的趨勢，特別是八氫番茄紅素和β-隱黃素的含量在采后5周后急劇增加；而低溫(4℃)貯藏誘導紅肉臍橙果肉八氫番茄紅素、番茄紅素、β-胡蘿卜素、β-隱黃素、葉黃素和紫黃質等的積累。根據前人報道，番茄紅素的最佳合成溫度為15～25℃，5℃的低溫能顯著抑制番茄紅素的合成[19]。因此，低溫條件下紅肉臍橙果肉番茄紅素的積累說明形成番茄紅素的上游途徑開始大量啟動。在植物類胡蘿卜代謝途徑中，八氫番茄紅素的合成是關鍵步驟之一，受八氫番茄紅素合成酶(PSY)基因的遺傳控制，該基因的表達與柑橘果實類胡蘿卜素含量呈明顯的正相關[9-11,20]。從代謝途徑分析，紅肉臍橙八氫番茄紅素含量增加可能與低溫誘導PSY基因上調表達有關。這一假設與總類胡蘿卜素含量和番茄紅素下游代謝物(如β-胡蘿卜素、β-隱黃素、葉黃素和紫黃質等)的增加相吻合。

4 結 論

本研究結果表明，貯藏溫度對紅肉臍橙果皮和果肉類胡蘿卜素含量的影響存在組織特異性。常溫(20℃)對紅肉臍橙果皮著色的積極作用只維持在貯藏的前5周；低溫(4℃)能基本保持貯藏初期果皮類胡蘿卜素含量，但含量低于常溫貯藏。除貯藏10周時β-胡蘿卜素、葉黃素、α-隱黃素含量有一個小幅增加外，常溫對紅肉臍橙果肉類胡蘿卜素總體影響不大；低溫貯藏的紅肉臍橙果肉類胡蘿卜素含量于采后1周達到峰值，隨后含量基本保持穩定。

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