脂肪添加量和凍藏時間對冷凍水餃肉餡肌原纖維蛋白氧化和凝膠特性的影響

黃 莉，孔保華*，夏秀芳，李 菁，趙鉅陽，馮金鳳，常 釗

(1.東北農業大學食品學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.日照職業技術學院食品工程學院，山東 日照 276826)

速凍水餃是深受人們喜愛的具有傳統特色的方便食品，隨著速凍產業的發展，生產冷鏈的健全，速凍水餃的生產量在逐年遞增，但速凍水餃在貯藏過程中食用品質會下降，口感變得粗糙。國外一些學者研究認為蛋白質的凝膠性是影響食品形成最佳質構和風味的重要因素[1-2]。肌肉蛋白凝膠的流變性質現已被廣泛研究，研究內容包括不同原料肌肉(牛肉、豬肉、魚肉)[3]，加工條件(鹽離子強度、pH值)、添加成分(磷酸鹽、抗氧化劑)等[4-5]對蛋白凝膠黏度彈性的影響，進而闡述加工條件對產品組織結構的影響。對于經過斬拌和重新成型的肉制品，肌原纖維蛋白形成凝膠的能力對產品的質地和黏聚性起到關鍵作用[6]。在東方國家，尤其是日本，為了使肌原纖維蛋白凝膠形成能力最大化，通常將肌肉斬拌。蛋白的凝膠化有益于產品形成最終的組織結構和風味特性[1]。但是，肉制品在加工貯藏過程中，由于溫度的波動、脂肪氧化、以及酶的作用，會使脂肪和蛋白質發生氧化。肌原纖維蛋白的氧化可以導致氨基酸側鏈基團的損傷、肽鍵的斷裂、蛋白質的交聯、變性、形成新的活性基團—羰基，增加對蛋白水解酶的敏感性等，并對蛋白凝膠的結構產生影響[7]。Xia Xiufang等[8-9]研究豬背部最長肌經過不同的冷凍-解凍循環，發現隨著循環次數的增加，肉中脂肪氧化和蛋白氧化程度加深，肌原纖維蛋白凝膠的保水性，凝膠性和乳化性均下降，凝膠的三維網狀結構變得疏松，從而導致肉的食用品質下降。

水餃肉餡是由瘦肉、動物脂肪、植物油、水、食鹽、香辛料等組成的一個非常復雜的不完全乳化體系，脂肪的添加有助于水餃形成鮮香多汁的口感，并且可以降低生產成本。在前期試驗中，本實驗組研究了不同脂肪添加量對速凍水餃在－18℃條件下貯藏0～180d的脂肪氧化程度及其品質的影響，表明隨著脂肪添加量的增加和凍藏時間的延長，水餃肉餡的脂肪氧化增加，顏色變差，并且水餃的蒸煮損失增加，彈性、硬度、黏聚性、咀嚼性整體上呈下降趨勢。本實驗進一步研究不同脂肪添加量對速凍水餃在不同的貯藏時間內，肉餡中肌原纖維蛋白氧化和凝膠性的變化對水餃感官品質的影響，以進一步揭示速凍水餃在貯藏過程中品質變化的本質，并為速凍水餃的生產貯藏提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉肩頸肉、背部肥膘 南京雨潤食品有限公司；金龍魚大豆油 嘉里糧油(營口)有限公司；五香粉 王守義十三香調味品有限公司；蔥姜 大潤發超市；醬油 海天調味食品有限公司；食鹽 中鹽紅波集團；面粉 海糧油工業有限公司。

實驗所用其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

TU-1800紫外-可見光分光光度計 北京普希通用儀器有限公司；MAL1038384流變儀 英國馬爾文儀器有限公司；Mini電泳儀 美國Bio-Rad公司；冷凍離心機 美國Beckman公司；HR2860型高速組織搗碎機 珠海經濟特區飛利浦家庭電器有限公司；凝膠成像系統 上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冷凍水餃的制作

取屠宰后排酸24h的豬肉肩頸肉和背部肥膘，用保溫箱加碎冰運至農大肉制品加工實驗室。在冷庫(4℃)中操作，剔除表面可見筋膜，切成小塊，用絞肉機絞碎，篩孔直徑4mmol/L。將肥肉、瘦肉、調味料、大豆油等輔料按表1比例添加，攪拌均勻，調制肉餡，稱量肉餡(10.0±0.1)g，包成餃子，盛于托盤中，放在–25℃冰柜中冷凍過夜(至少20h)，取出后用保鮮袋分裝，此時取部分樣品用于測量0月的各指標。將分裝好的水餃貯存于－18℃冰柜，待測其他各月的指標。

表 1 冷凍水餃肉餡的配方Table 1 Formulas of ground meat in frozen dumplings g

1.3.2 羰基含量的測定

肌原纖維蛋白提?。簠⒖糚ark等[7]的方法，取出凍藏的水餃肉餡，放在4℃冰箱中解凍，待中心溫度至0℃左右時，剝掉水餃面皮，稱量肉餡并提取肌原纖維蛋白；羰基含量測定：參照Xia Xiufang等[9]的方法。

1.3.3 肌原纖維蛋白凝膠的流變學測定

肌原纖維蛋白凝膠黏彈性可以通過動力流變學試驗測定，儲能模量(storage modulus，G’)可以闡明蛋白質凝膠和蛋白質網狀結構形成的機理。測試方法依據Xia Xiufang等[8]的方法并略作修改。將從水餃肉餡中提取的肌原纖維蛋白溶解在0.1mol/L NaCl溶液中配制成40mg/mL的溶液。在動態流變儀中使用直徑60mmol/L的平行板來實現小振幅的剪切測試，平行板間的空隙選擇1mmol/L、加熱速率1℃/min、溫度范圍為30～85℃，并在85℃保持3min，振蕩頻率0.1Hz、應力振幅0.02。為防止試驗過程中的水分蒸發，在夾具固定的保溫環中加入蒸餾水并使用保溫套罩住夾具和樣品。

1.3.4 肌原纖維蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

將從不同脂肪含量的水餃肉餡中提取的肌原纖維蛋白用樣品溶解液(pH6.8的Tris-HCl緩沖液、10% β-巰基乙醇溶液、20%甘油溶液)稀釋成1mg/mL的溶液?；旌衔?00℃水浴3min，備用。

參照Park等[7]和郭堯軍[10]的SDS不連續電泳方法，濃縮膠質量濃度5g/100mL、分離膠質量濃度10g/100mL。獲得的電泳膠片置于天能凝膠成像儀攝像，結合Tanon軟件進行分析和處理。SDS-PAGE標準分子質量蛋白由中科院上海生物化學研究所提供。

1.3.5 水餃的感官評價

熟制的水餃的感官評價是由感官評價小組在感官評價室完成的。感官評價小組是由8位受過專業訓練的人員組成并具有肉制品的感官評價經驗。感官評價的指標包括水餃的質構、多汁性、酸敗味和整體接受性。每個評價者每組評價兩個餃子，在煮制后立即進行評價。評價指標采用10分制。對于質構，1=粗糙，10=光滑；對于多汁性，1=干燥，10=多汁；對于酸敗，1=感覺不到，10=嚴重的刺激氣味；對于整體接受性，1=低，10=高。樣品評價的間歇，評價人員用溫水漱口并處在正常燈光下，樣品是隨機發給每個評價人員的。

1.4 數據統計分析

2 結果與分析

2.1 冷凍水餃肉餡在凍藏期間的蛋白氧化

肌原纖維蛋白羰基的形成(醛基和酮基)是蛋白質發生氧化后一個顯著變化，羰基被廣泛地用于測量蛋白質的氧化程度。從圖1可知，貯藏0d的水餃肉餡中肌原纖維蛋白中羰基含量為1.52～1.93nmol/mg蛋白，這個結果與Morzel等[11]從新鮮的豬背部最長肌中提取的肌原纖維蛋白(1.70nmol/mg蛋白)的羰基含量非常接近。隨著貯藏時間的延長和脂肪添加量的增加，羰基含量顯著增加(P＜0.05)。冷凍水餃貯藏180d時，各組中羰基含量是貯藏0d時羰基含量的2倍左右，添加脂肪的各組中羰基含量顯著高于未添加脂肪組(P＜0.05)。脂肪氧化產物會引發蛋白氧化產生更多的羰基[12-13]，隨著脂肪添加量的增加，水餃肉餡中脂肪氧化產物增加，因此羰基的含量迅速增加。羰基含量的增加與肌肉中蛋白質功能性的下降相關，比如蒸煮損失的增加，凝膠性下降等。Liu Zelong等[14]表明豬肉背部最長肌肌肉在40mmol/L和50mmol/L H2O2條件下氧化2min，或者在20mmol/L H2O2氧化40min，蛋白質羰基顯著增加，肉的持水力和肉的重量顯著地下降。關于蛋白氧化降低肉的持水力，Huff-Lonergan等[15]認為，肌肉在動物死后僵直、成熟的過程中會增加肌原纖維蛋白氧化，降低蛋白的功能性。因為μ-鈣蛋白酶(Calpain)和m-鈣蛋白酶的活性位點包含組氨酸和含有巰基的半胱氨酸的殘基，他們易因氧化而鈍化。氧化可以導致肌肉中鈣蛋白酶失活或者被修飾，進而影響鈣蛋白酶的活性和蛋白水解，并影響肉品的品質如嫩度和持水性。

圖 1 脂肪添加量對冷凍水餃肉餡凍藏過程中羰基含量的影響Fig.1 Effect of fat content on carbonyl content of dumpling fillers during frozen storage

2.2 冷凍水餃肉餡在凍藏期間肌原纖維蛋白凝膠性的變化

肌原纖維蛋白形成凝膠的能力是肉制品加工中的一個重要功能特性，與其他功能性共同作用賦予了肉制品的黏彈性、多汁性、質構等性質，加工條件如pH值、離子強度、肌肉的類型等會影響肌原纖維蛋白的持水性和黏彈性[3]。肌原纖維蛋白凝膠流變學變化如圖2所示。儲能模量的值(G′)通常被用來衡量物質(材料)結構特性的變化，顯示樣品主要的彈性行為的熱流變性[16]。貯藏0d的未添加脂肪的水餃肉餡中提取的肌原纖維蛋白的凝膠流變曲線變化表明，加熱到35℃，G′稍有增加，這時凝膠網絡結構開始形成。在36～57℃ G′明顯增加，這說明這個蛋白凝膠體系呈現出更具有彈性的結構。肌球蛋白的尾部與尾部通過疏水鍵相互作用促進了G′和彈性的增加[17]。這表明肌原纖維蛋白中起到熱凝膠作用的蛋白質主要是肌球蛋白，肌球蛋白的輕鏈在蛋白質結構部分伸展時從重鏈中分離出來，形成三維結構。繼續加熱，G′迅速降低至69℃又迅速增加，表明形成了不可逆的凝膠網絡結構。隨著貯藏時間的延長，肌原纖維蛋白的儲能模量值均下降，峰值對應的溫度降低。對于未添加脂肪的樣品，凍藏時間分別為0、30、60、90、180d，G′對應的最大值分別是5727(56.9℃)、4943.8(55.0℃)、3001.5(55.7℃)、3707.8(54℃)、2428.3Pa(53℃)，可以看出G′的變化趨勢是隨著凍藏時間的延長，G′的最大值逐漸減小，G′最大值對應的溫度不斷減小，這說明在凍藏過程中肌原纖維蛋白的變性程度不斷加深，G′數值的降低可能是由于肌動蛋白的復合物的分離和肌球蛋白尾部的變性引起的。其他添加不同量的脂肪的組中G′的變化趨勢與未添加脂肪的組一致。從貯藏30、90、180d的G′曲線可以看出，隨著脂肪添加量的增加，G′的數值逐漸下降，脂肪添加量為40%、貯藏180d的水餃樣品提取的肌原纖維蛋白的G′曲線已經變成平滑曲線，這說明隨著溫度的升高，肌球蛋白的輕鏈和重鏈經歷了構型上的變化，片段化，增加了流動性[1,17]，肌原纖維蛋白已經完全變性。

圖 2 脂肪添加量對冷凍水餃肉餡凍藏過程中肌原纖維蛋白凝膠特性的影響Fig.2 Effect of fat content on gelation of porcine myofibrillar protein in dumpling fillers during frozen storage

2.3 冷凍水餃肉餡在凍藏期間肌原纖維聚集情況的變化

圖 3 脂肪添加量對冷凍水餃肉餡凍藏過程中肌原纖維蛋白聚集情況的影響Fig.3 Effect of fat content on porcine myofibrillar protein aggregation of dumpling fillers during frozen storage

圖3為從不同貯藏時間的水餃肉餡中提取的肌原纖維蛋白在10%的電泳凝膠中的蛋白質條帶。圖4為利用Tanon軟件對肌球蛋白重鏈和肌動蛋白條帶的變化進行定量分析。從圖3、4可以看出，對于相同脂肪添加量的水餃肉餡，隨著貯藏時間的延長，肌原纖維蛋白中的肌球蛋白和肌動蛋白的含量整體上是呈下降的趨勢的，這說明在貯藏過程中的發生的氧化反應不完全是二硫鍵的交聯作用，它可能包括羰基和氨基集團之間西弗堿(schiff bases)的形成[14]。隨著脂肪添加量的增加，肌球蛋白和肌動蛋白的含量也呈下降趨勢，這說明肌球蛋白重鏈和肌動蛋白發生了不同程度的聚合或降解。對于相同脂肪添加量的樣品，肌球蛋白的輕鏈1隨著貯藏時間的延長，條帶變淺；肌球蛋白輕鏈2變化更明顯些，貯藏180d時，已經沒有條帶了，這說明肌球蛋白的輕鏈2已經完全被氧化降解或生成了其他物質。氧化的肌原纖維蛋白產生羰基，羰基可以與未氧化的氨基酸的游離氨基形成氨基化合物。如果在不同的蛋白質之間發生這種反應，它可以導致蛋白質的聚合和聚集。同樣，巰基氧化可導致二硫鍵產生分子內交聯[11]。

圖 4 脂肪添加量對肌原纖維蛋白中肌球蛋白和肌動蛋白含量在凍藏過程中的變化影響Fig.4 Effect of fat content on percent content of myosin and actin in porcine myofibrillar protein in dumplings fillers during frozen storage

2.4 冷凍水餃肉餡在凍藏期間感官品質的變化

表 2 冷凍水餃的感官評價表Table 2 Sensory evaluations of dumplings

由表2可知，隨著脂肪添加量的增加，水餃的質地的光滑性和多汁性顯著增加(P＜0.05)，但脂肪添加量40% 組中質構和多汁性得分較低，這可能是因為該組中因含有較高的脂肪含量而蛋白含量降低，使得蛋白對脂肪和水的保持能力下降，在熟制過程中脂肪和水分流失較多，這一點和前期的研究中蒸煮損失隨著脂肪添加量的增加而增加是一致的。對于酸敗味來說，脂肪在凍藏過程中會發生脂肪氧化，而脂肪氧化的終產物(醛、酮類)會產生酸敗味，較高的脂肪添加量產生較多的醛和酮類物質，所以脂肪含量高的樣品中酸敗味會更明顯。此外，凍藏時間也顯著地影響水餃的感官品質。隨著凍藏時間延長，尤其是在90d后，水餃的質地明顯地粗糙(P＜0.05)，多汁性顯著降低(P＜0.05)，酸敗味顯著增加(P＜0.05)，整體接受性顯著變差(P＜0.05)。質地變得粗糙，這與蛋白的凝膠性在90d后顯著下降是一致的。在肉制品中，碎肉中的肌原纖維蛋白形成凝膠對制品的黏聚性和質構特征起決定作用。隨著凍藏時間的延長，肌原纖維蛋白的凝膠性變差，導致水餃的質地變得粗糙。水餃的多汁性降低可能是因為在凍藏過程中冰晶的增加和蛋白發生氧化變性而使蛋白結合的水分減少[18]，蛋白和醛類相互作用導致蛋白變性和聚集，使肉制品的質地變得堅硬[19]。

3 結 論

隨著貯藏時間延長和脂肪添加量的增加，水餃肉餡中肌原纖維蛋白的羰基含量增加，儲能模量G′的峰值降低，對應的變性溫度降低，肌球蛋白和肌動蛋白的百分含量下降，表明肌原纖維蛋白的氧化加重，凝膠的黏彈性下降，肌原纖維蛋白的變性程度增加。水餃的質地變得粗糙，多汁性和總體接受性下降。所以冷凍水餃的肉餡在凍藏過程中品質降低的主要原因是肉餡中的肌原纖維蛋白因氧化變性而導致肌球蛋白和肌動蛋白發生不同程度的聚合或降解，使其形成凝膠的能力和持水能力下降。建議冷凍水餃在加工凍藏過程中應考慮生產配方，選擇合適比例的背膘以兼顧生產成本和水餃的貯藏質量，盡量減少肌原纖維蛋白的氧化變性程度，以保持水餃鮮嫩多汁的口感。

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