脂肪添加量和凍藏時(shí)間對冷凍水餃肉餡肌原纖維蛋白氧化和凝膠特性的影響

黃 莉，孔保華*，夏秀芳，李 菁，趙鉅陽，馮金鳳，常 釗

(1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.日照職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品工程學(xué)院，山東 日照 276826)

速凍水餃?zhǔn)巧钍苋藗兿矏鄣木哂袀鹘y(tǒng)特色的方便食品，隨著速凍產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，生產(chǎn)冷鏈的健全，速凍水餃的生產(chǎn)量在逐年遞增，但速凍水餃在貯藏過程中食用品質(zhì)會(huì)下降，口感變得粗糙。國外一些學(xué)者研究認(rèn)為蛋白質(zhì)的凝膠性是影響食品形成最佳質(zhì)構(gòu)和風(fēng)味的重要因素[1-2]。肌肉蛋白凝膠的流變性質(zhì)現(xiàn)已被廣泛研究，研究內(nèi)容包括不同原料肌肉(牛肉、豬肉、魚肉)[3]，加工條件(鹽離子強(qiáng)度、pH值)、添加成分(磷酸鹽、抗氧化劑)等[4-5]對蛋白凝膠黏度彈性的影響，進(jìn)而闡述加工條件對產(chǎn)品組織結(jié)構(gòu)的影響。對于經(jīng)過斬拌和重新成型的肉制品，肌原纖維蛋白形成凝膠的能力對產(chǎn)品的質(zhì)地和黏聚性起到關(guān)鍵作用[6]。在東方國家，尤其是日本，為了使肌原纖維蛋白凝膠形成能力最大化，通常將肌肉斬拌。蛋白的凝膠化有益于產(chǎn)品形成最終的組織結(jié)構(gòu)和風(fēng)味特性[1]。但是，肉制品在加工貯藏過程中，由于溫度的波動(dòng)、脂肪氧化、以及酶的作用，會(huì)使脂肪和蛋白質(zhì)發(fā)生氧化。肌原纖維蛋白的氧化可以導(dǎo)致氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)的損傷、肽鍵的斷裂、蛋白質(zhì)的交聯(lián)、變性、形成新的活性基團(tuán)—羰基，增加對蛋白水解酶的敏感性等，并對蛋白凝膠的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生影響[7]。Xia Xiufang等[8-9]研究豬背部最長肌經(jīng)過不同的冷凍-解凍循環(huán)，發(fā)現(xiàn)隨著循環(huán)次數(shù)的增加，肉中脂肪氧化和蛋白氧化程度加深，肌原纖維蛋白凝膠的保水性，凝膠性和乳化性均下降，凝膠的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)變得疏松，從而導(dǎo)致肉的食用品質(zhì)下降。

水餃肉餡是由瘦肉、動(dòng)物脂肪、植物油、水、食鹽、香辛料等組成的一個(gè)非常復(fù)雜的不完全乳化體系，脂肪的添加有助于水餃形成鮮香多汁的口感，并且可以降低生產(chǎn)成本。在前期試驗(yàn)中，本實(shí)驗(yàn)組研究了不同脂肪添加量對速凍水餃在－18℃條件下貯藏0～180d的脂肪氧化程度及其品質(zhì)的影響，表明隨著脂肪添加量的增加和凍藏時(shí)間的延長，水餃肉餡的脂肪氧化增加，顏色變差，并且水餃的蒸煮損失增加，彈性、硬度、黏聚性、咀嚼性整體上呈下降趨勢。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究不同脂肪添加量對速凍水餃在不同的貯藏時(shí)間內(nèi)，肉餡中肌原纖維蛋白氧化和凝膠性的變化對水餃感官品質(zhì)的影響，以進(jìn)一步揭示速凍水餃在貯藏過程中品質(zhì)變化的本質(zhì)，并為速凍水餃的生產(chǎn)貯藏提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉肩頸肉、背部肥膘 南京雨潤食品有限公司；金龍魚大豆油 嘉里糧油(營口)有限公司；五香粉 王守義十三香調(diào)味品有限公司；蔥姜 大潤發(fā)超市；醬油 海天調(diào)味食品有限公司；食鹽 中鹽紅波集團(tuán)；面粉 海糧油工業(yè)有限公司。

實(shí)驗(yàn)所用其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1800紫外-可見光分光光度計(jì) 北京普希通用儀器有限公司；MAL1038384流變儀 英國馬爾文儀器有限公司；Mini電泳儀 美國Bio-Rad公司；冷凍離心機(jī) 美國Beckman公司；HR2860型高速組織搗碎機(jī) 珠海經(jīng)濟(jì)特區(qū)飛利浦家庭電器有限公司；凝膠成像系統(tǒng) 上海天能科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 冷凍水餃的制作

取屠宰后排酸24h的豬肉肩頸肉和背部肥膘，用保溫箱加碎冰運(yùn)至農(nóng)大肉制品加工實(shí)驗(yàn)室。在冷庫(4℃)中操作，剔除表面可見筋膜，切成小塊，用絞肉機(jī)絞碎，篩孔直徑4mmol/L。將肥肉、瘦肉、調(diào)味料、大豆油等輔料按表1比例添加，攪拌均勻，調(diào)制肉餡，稱量肉餡(10.0±0.1)g，包成餃子，盛于托盤中，放在–25℃冰柜中冷凍過夜(至少20h)，取出后用保鮮袋分裝，此時(shí)取部分樣品用于測量0月的各指標(biāo)。將分裝好的水餃貯存于－18℃冰柜，待測其他各月的指標(biāo)。

表 1 冷凍水餃肉餡的配方Table 1 Formulas of ground meat in frozen dumplings g

1.3.2 羰基含量的測定

肌原纖維蛋白提取：參考Park等[7]的方法，取出凍藏的水餃肉餡，放在4℃冰箱中解凍，待中心溫度至0℃左右時(shí)，剝掉水餃面皮，稱量肉餡并提取肌原纖維蛋白；羰基含量測定：參照Xia Xiufang等[9]的方法。

1.3.3 肌原纖維蛋白凝膠的流變學(xué)測定

肌原纖維蛋白凝膠黏彈性可以通過動(dòng)力流變學(xué)試驗(yàn)測定，儲(chǔ)能模量(storage modulus，G’)可以闡明蛋白質(zhì)凝膠和蛋白質(zhì)網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)形成的機(jī)理。測試方法依據(jù)Xia Xiufang等[8]的方法并略作修改。將從水餃肉餡中提取的肌原纖維蛋白溶解在0.1mol/L NaCl溶液中配制成40mg/mL的溶液。在動(dòng)態(tài)流變儀中使用直徑60mmol/L的平行板來實(shí)現(xiàn)小振幅的剪切測試，平行板間的空隙選擇1mmol/L、加熱速率1℃/min、溫度范圍為30～85℃，并在85℃保持3min，振蕩頻率0.1Hz、應(yīng)力振幅0.02。為防止試驗(yàn)過程中的水分蒸發(fā)，在夾具固定的保溫環(huán)中加入蒸餾水并使用保溫套罩住夾具和樣品。

1.3.4 肌原纖維蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

將從不同脂肪含量的水餃肉餡中提取的肌原纖維蛋白用樣品溶解液(pH6.8的Tris-HCl緩沖液、10% β-巰基乙醇溶液、20%甘油溶液)稀釋成1mg/mL的溶液。混合物100℃水浴3min，備用。

參照Park等[7]和郭堯軍[10]的SDS不連續(xù)電泳方法，濃縮膠質(zhì)量濃度5g/100mL、分離膠質(zhì)量濃度10g/100mL。獲得的電泳膠片置于天能凝膠成像儀攝像，結(jié)合Tanon軟件進(jìn)行分析和處理。SDS-PAGE標(biāo)準(zhǔn)分子質(zhì)量蛋白由中科院上海生物化學(xué)研究所提供。

1.3.5 水餃的感官評(píng)價(jià)

熟制的水餃的感官評(píng)價(jià)是由感官評(píng)價(jià)小組在感官評(píng)價(jià)室完成的。感官評(píng)價(jià)小組是由8位受過專業(yè)訓(xùn)練的人員組成并具有肉制品的感官評(píng)價(jià)經(jīng)驗(yàn)。感官評(píng)價(jià)的指標(biāo)包括水餃的質(zhì)構(gòu)、多汁性、酸敗味和整體接受性。每個(gè)評(píng)價(jià)者每組評(píng)價(jià)兩個(gè)餃子，在煮制后立即進(jìn)行評(píng)價(jià)。評(píng)價(jià)指標(biāo)采用10分制。對于質(zhì)構(gòu)，1=粗糙，10=光滑；對于多汁性，1=干燥，10=多汁；對于酸敗，1=感覺不到，10=嚴(yán)重的刺激氣味；對于整體接受性，1=低，10=高。樣品評(píng)價(jià)的間歇，評(píng)價(jià)人員用溫水漱口并處在正常燈光下，樣品是隨機(jī)發(fā)給每個(gè)評(píng)價(jià)人員的。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 冷凍水餃肉餡在凍藏期間的蛋白氧化

肌原纖維蛋白羰基的形成(醛基和酮基)是蛋白質(zhì)發(fā)生氧化后一個(gè)顯著變化，羰基被廣泛地用于測量蛋白質(zhì)的氧化程度。從圖1可知，貯藏0d的水餃肉餡中肌原纖維蛋白中羰基含量為1.52～1.93nmol/mg蛋白，這個(gè)結(jié)果與Morzel等[11]從新鮮的豬背部最長肌中提取的肌原纖維蛋白(1.70nmol/mg蛋白)的羰基含量非常接近。隨著貯藏時(shí)間的延長和脂肪添加量的增加，羰基含量顯著增加(P＜0.05)。冷凍水餃貯藏180d時(shí)，各組中羰基含量是貯藏0d時(shí)羰基含量的2倍左右，添加脂肪的各組中羰基含量顯著高于未添加脂肪組(P＜0.05)。脂肪氧化產(chǎn)物會(huì)引發(fā)蛋白氧化產(chǎn)生更多的羰基[12-13]，隨著脂肪添加量的增加，水餃肉餡中脂肪氧化產(chǎn)物增加，因此羰基的含量迅速增加。羰基含量的增加與肌肉中蛋白質(zhì)功能性的下降相關(guān)，比如蒸煮損失的增加，凝膠性下降等。Liu Zelong等[14]表明豬肉背部最長肌肌肉在40mmol/L和50mmol/L H2O2條件下氧化2min，或者在20mmol/L H2O2氧化40min，蛋白質(zhì)羰基顯著增加，肉的持水力和肉的重量顯著地下降。關(guān)于蛋白氧化降低肉的持水力，Huff-Lonergan等[15]認(rèn)為，肌肉在動(dòng)物死后僵直、成熟的過程中會(huì)增加肌原纖維蛋白氧化，降低蛋白的功能性。因?yàn)棣?鈣蛋白酶(Calpain)和m-鈣蛋白酶的活性位點(diǎn)包含組氨酸和含有巰基的半胱氨酸的殘基，他們易因氧化而鈍化。氧化可以導(dǎo)致肌肉中鈣蛋白酶失活或者被修飾，進(jìn)而影響鈣蛋白酶的活性和蛋白水解，并影響肉品的品質(zhì)如嫩度和持水性。

圖 1 脂肪添加量對冷凍水餃肉餡凍藏過程中羰基含量的影響Fig.1 Effect of fat content on carbonyl content of dumpling fillers during frozen storage

2.2 冷凍水餃肉餡在凍藏期間肌原纖維蛋白凝膠性的變化

肌原纖維蛋白形成凝膠的能力是肉制品加工中的一個(gè)重要功能特性，與其他功能性共同作用賦予了肉制品的黏彈性、多汁性、質(zhì)構(gòu)等性質(zhì)，加工條件如pH值、離子強(qiáng)度、肌肉的類型等會(huì)影響肌原纖維蛋白的持水性和黏彈性[3]。肌原纖維蛋白凝膠流變學(xué)變化如圖2所示。儲(chǔ)能模量的值(G′)通常被用來衡量物質(zhì)(材料)結(jié)構(gòu)特性的變化，顯示樣品主要的彈性行為的熱流變性[16]。貯藏0d的未添加脂肪的水餃肉餡中提取的肌原纖維蛋白的凝膠流變曲線變化表明，加熱到35℃，G′稍有增加，這時(shí)凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)開始形成。在36～57℃ G′明顯增加，這說明這個(gè)蛋白凝膠體系呈現(xiàn)出更具有彈性的結(jié)構(gòu)。肌球蛋白的尾部與尾部通過疏水鍵相互作用促進(jìn)了G′和彈性的增加[17]。這表明肌原纖維蛋白中起到熱凝膠作用的蛋白質(zhì)主要是肌球蛋白，肌球蛋白的輕鏈在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部分伸展時(shí)從重鏈中分離出來，形成三維結(jié)構(gòu)。繼續(xù)加熱，G′迅速降低至69℃又迅速增加，表明形成了不可逆的凝膠網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。隨著貯藏時(shí)間的延長，肌原纖維蛋白的儲(chǔ)能模量值均下降，峰值對應(yīng)的溫度降低。對于未添加脂肪的樣品，凍藏時(shí)間分別為0、30、60、90、180d，G′對應(yīng)的最大值分別是5727(56.9℃)、4943.8(55.0℃)、3001.5(55.7℃)、3707.8(54℃)、2428.3Pa(53℃)，可以看出G′的變化趨勢是隨著凍藏時(shí)間的延長，G′的最大值逐漸減小，G′最大值對應(yīng)的溫度不斷減小，這說明在凍藏過程中肌原纖維蛋白的變性程度不斷加深，G′數(shù)值的降低可能是由于肌動(dòng)蛋白的復(fù)合物的分離和肌球蛋白尾部的變性引起的。其他添加不同量的脂肪的組中G′的變化趨勢與未添加脂肪的組一致。從貯藏30、90、180d的G′曲線可以看出，隨著脂肪添加量的增加，G′的數(shù)值逐漸下降，脂肪添加量為40%、貯藏180d的水餃樣品提取的肌原纖維蛋白的G′曲線已經(jīng)變成平滑曲線，這說明隨著溫度的升高，肌球蛋白的輕鏈和重鏈經(jīng)歷了構(gòu)型上的變化，片段化，增加了流動(dòng)性[1,17]，肌原纖維蛋白已經(jīng)完全變性。

圖 2 脂肪添加量對冷凍水餃肉餡凍藏過程中肌原纖維蛋白凝膠特性的影響Fig.2 Effect of fat content on gelation of porcine myofibrillar protein in dumpling fillers during frozen storage

2.3 冷凍水餃肉餡在凍藏期間肌原纖維聚集情況的變化

圖 3 脂肪添加量對冷凍水餃肉餡凍藏過程中肌原纖維蛋白聚集情況的影響Fig.3 Effect of fat content on porcine myofibrillar protein aggregation of dumpling fillers during frozen storage

圖3為從不同貯藏時(shí)間的水餃肉餡中提取的肌原纖維蛋白在10%的電泳凝膠中的蛋白質(zhì)條帶。圖4為利用Tanon軟件對肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白條帶的變化進(jìn)行定量分析。從圖3、4可以看出，對于相同脂肪添加量的水餃肉餡，隨著貯藏時(shí)間的延長，肌原纖維蛋白中的肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的含量整體上是呈下降的趨勢的，這說明在貯藏過程中的發(fā)生的氧化反應(yīng)不完全是二硫鍵的交聯(lián)作用，它可能包括羰基和氨基集團(tuán)之間西弗堿(schiff bases)的形成[14]。隨著脂肪添加量的增加，肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的含量也呈下降趨勢，這說明肌球蛋白重鏈和肌動(dòng)蛋白發(fā)生了不同程度的聚合或降解。對于相同脂肪添加量的樣品，肌球蛋白的輕鏈1隨著貯藏時(shí)間的延長，條帶變淺；肌球蛋白輕鏈2變化更明顯些，貯藏180d時(shí)，已經(jīng)沒有條帶了，這說明肌球蛋白的輕鏈2已經(jīng)完全被氧化降解或生成了其他物質(zhì)。氧化的肌原纖維蛋白產(chǎn)生羰基，羰基可以與未氧化的氨基酸的游離氨基形成氨基化合物。如果在不同的蛋白質(zhì)之間發(fā)生這種反應(yīng)，它可以導(dǎo)致蛋白質(zhì)的聚合和聚集。同樣，巰基氧化可導(dǎo)致二硫鍵產(chǎn)生分子內(nèi)交聯(lián)[11]。

圖 4 脂肪添加量對肌原纖維蛋白中肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白含量在凍藏過程中的變化影響Fig.4 Effect of fat content on percent content of myosin and actin in porcine myofibrillar protein in dumplings fillers during frozen storage

2.4 冷凍水餃肉餡在凍藏期間感官品質(zhì)的變化

表 2 冷凍水餃的感官評(píng)價(jià)表Table 2 Sensory evaluations of dumplings

由表2可知，隨著脂肪添加量的增加，水餃的質(zhì)地的光滑性和多汁性顯著增加(P＜0.05)，但脂肪添加量40% 組中質(zhì)構(gòu)和多汁性得分較低，這可能是因?yàn)樵摻M中因含有較高的脂肪含量而蛋白含量降低，使得蛋白對脂肪和水的保持能力下降，在熟制過程中脂肪和水分流失較多，這一點(diǎn)和前期的研究中蒸煮損失隨著脂肪添加量的增加而增加是一致的。對于酸敗味來說，脂肪在凍藏過程中會(huì)發(fā)生脂肪氧化，而脂肪氧化的終產(chǎn)物(醛、酮類)會(huì)產(chǎn)生酸敗味，較高的脂肪添加量產(chǎn)生較多的醛和酮類物質(zhì)，所以脂肪含量高的樣品中酸敗味會(huì)更明顯。此外，凍藏時(shí)間也顯著地影響水餃的感官品質(zhì)。隨著凍藏時(shí)間延長，尤其是在90d后，水餃的質(zhì)地明顯地粗糙(P＜0.05)，多汁性顯著降低(P＜0.05)，酸敗味顯著增加(P＜0.05)，整體接受性顯著變差(P＜0.05)。質(zhì)地變得粗糙，這與蛋白的凝膠性在90d后顯著下降是一致的。在肉制品中，碎肉中的肌原纖維蛋白形成凝膠對制品的黏聚性和質(zhì)構(gòu)特征起決定作用。隨著凍藏時(shí)間的延長，肌原纖維蛋白的凝膠性變差，導(dǎo)致水餃的質(zhì)地變得粗糙。水餃的多汁性降低可能是因?yàn)樵趦霾剡^程中冰晶的增加和蛋白發(fā)生氧化變性而使蛋白結(jié)合的水分減少[18]，蛋白和醛類相互作用導(dǎo)致蛋白變性和聚集，使肉制品的質(zhì)地變得堅(jiān)硬[19]。

3 結(jié) 論

隨著貯藏時(shí)間延長和脂肪添加量的增加，水餃肉餡中肌原纖維蛋白的羰基含量增加，儲(chǔ)能模量G′的峰值降低，對應(yīng)的變性溫度降低，肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白的百分含量下降，表明肌原纖維蛋白的氧化加重，凝膠的黏彈性下降，肌原纖維蛋白的變性程度增加。水餃的質(zhì)地變得粗糙，多汁性和總體接受性下降。所以冷凍水餃的肉餡在凍藏過程中品質(zhì)降低的主要原因是肉餡中的肌原纖維蛋白因氧化變性而導(dǎo)致肌球蛋白和肌動(dòng)蛋白發(fā)生不同程度的聚合或降解，使其形成凝膠的能力和持水能力下降。建議冷凍水餃在加工凍藏過程中應(yīng)考慮生產(chǎn)配方，選擇合適比例的背膘以兼顧生產(chǎn)成本和水餃的貯藏質(zhì)量，盡量減少肌原纖維蛋白的氧化變性程度，以保持水餃鮮嫩多汁的口感。

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