補陽還五湯對血管性癡呆大鼠海馬CA1區LTP及ERK2與CaMKIIβ mRNA表達的影響

唐敬龍， 高維娟， 錢 濤， 張泓波， 李 君

血管性癡呆(Vascular Dementia，VD)是指各種腦血管病引起腦功能障礙而產生的獲得性智能損害綜合征，為一慢性進行性疾病，長時程增強(longterm-potentiation，LTP)效應反映神經元突觸可塑性，是學習和記憶的突觸模型［1］，反映了突觸水平的記憶過程［2，3］，因此 LTP 被公認為是學習和記憶的神經生物學基礎［4］。細胞外信號調節激酶2(Extracellular signal-regulated kinase，ERK2)參與海馬神經元的可塑性，鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱβ(calci-um/calmodulin-dependent protein kinase Ⅱ β，CaMKIIβ)則參與突觸構建過程，促進學習記憶的恢復［5］。補陽還五湯是益氣活血中藥的代表，是中醫治療“呆病”的經典方劑，已經證實其有顯著的抗VD 作用［6～9］，但其電生理機制尚未闡明，本實驗采用在體大鼠海馬CA3側枝-CA1區長時程增強記錄方法記錄海馬CA1區LTP，采用RT-PCR技術檢測其海馬組織ERK2和CaMKIIβ mRNA的表達，從電生理角度、基因水平探討補陽還五湯對VD大鼠海馬神經元突觸可塑性的影響。

1 材料與方法

1.1 VD動物模型制備及分組 成年SD雄性大鼠40只，體重220±20g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號:SCXK(京)2007-0001，SPF級。通過水迷宮試驗篩選出智力水平相當的大鼠，并隨機分為假手術組，模型組，補陽還五湯組，尼莫地平組，每組10只。采用四血管阻斷(four-vessel occlusion，4VO)方法制備 VD動物模型［9］:大鼠于術前 12h禁食，4h禁水，戊巴比妥鈉(45mg/kg)腹腔麻醉。將大鼠伏臥固定于固定臺上，行背側頸正中切口，逐層鈍性分離暴露雙側第1頸椎橫突翼小孔，用直徑0.5mm的電凝針燒灼雙側翼小孔內的椎動脈，造成永久性閉塞。24h后再將大鼠麻醉，仰臥固定，行腹側頸正中切口，鈍性分離雙側頸總動脈，用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈5min，共夾閉3次，每次間隔1h。假手術組只做皮膚切口和組織分離處理，不進行椎動脈燒灼和頸總動脈夾閉，皮膚縫合后正常飼養。模型組大鼠造模后自然飼養;補陽還五湯組、尼莫地平組大鼠造模后分別灌服補陽還五湯(50g/kg/d)和尼莫地平(20mg/kg/d);模型組、假手術組均給予生理鹽水(10ml/kg/d)灌胃，2 次/d，連續給藥30d。

1.2 藥物制備 補陽還五湯購自北京同仁堂醫藥公司，批號為080103;按原方所載的各藥(黃芪120g:當歸尾6g:赤勺4.5g:地龍3g:川芎3g:紅花3g:桃仁3g)配方，制成濃度為 6.25g生藥/ml的混懸液。尼莫地平，國藥準字 H41022175，批號為080317，規格20mg/片:用雙蒸水經超聲細胞粉碎機制成濃度為2.5mg/ml的混懸液，高壓滅菌，4℃保存，用前搖勻。

1.3 主要儀器 WH-A300W型高頻電刀(北京市朝陽維思通工程電器廠)，LW2II型Morris水迷宮(中國醫學科學院藥物所);SR-6N型頭顱立體定位儀(Narishinge，Japan);M0310型牙科鉆，淮安市天劍工具廠;PowerLab信號采集分析系統(Australia)。

1.4 大鼠行為學檢測 采用Morris水迷宮實驗檢測各組大鼠空間探索行為能力，判斷各組大鼠空間記憶的認知能力。空間探索實驗:術后29d撤除平臺，將大鼠放入水池中，記錄大鼠在90s內在各象限游泳的距離和平臺象限距離占總距離的百分比。

1.5 大鼠海馬CA3側枝-CA1區長時程增強記錄 術后30d，用30%烏拉坦(4ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，固定于頭顱立體定位儀。大鼠頭頂部剪毛備皮，碘伏消毒，切開大約1.5cm皮膚切口，暴露顱骨。以刺激電極和記錄電極在顱骨的投影位置使用牙科鉆在顱骨打開一個直徑約5mm圓形窗口。

以前囟為參考點分別定位刺激電極和記錄電極位置。刺激電極位置在前囟后4.2mm，向左旁開3.5mm;記錄電極在前囟后 3.5mm，向左旁開2.5mm。將刺激電極和記錄電極輕輕插入左側海馬，刺激電極的深度為腦膜下2.5mm，記錄電極的深度為腦膜下2mm。放置刺激電極和記錄電極后，刺激電極與PowerLab的刺激器連接，記錄電極與經前置放大器與濾波及放大器相連，LTP信號經濾波(Neurolog NL 104;NL 125)及PowerLab轉換獲得。在scope軟件窗口中記錄興奮性突觸后電位(EPSP)，調節兩個電極的位置，以引出最大EPSP為目的。隨后給予單刺激，刺激強度從 0.1mA到1.0mA，記錄在不同刺激強度下EPSP。以達到最大EPSP負向波幅深度的1/3的所用的刺激強度作為記錄電流強度，每分鐘給予3次刺激，共20min。記錄基礎EPSP，記錄后給予高頻刺激(頻率為200Hz的串刺激，脈沖組數為10，主周期為2S，重復次數為10)。然后再給予每分鐘3次的刺激，記錄60min。分析興奮性EPSP的斜率。

1.6 RT-PCR檢測海馬組織ERK2和CaMKIIβ的表達 用Trizol一步法提取RNA，按Takara RNA PCR kit說明逆轉錄為cDNA。內參照β-actin的引物序列上游引物為5’CACCCGCGA GTACAACCTTC-3’，下游引物為 5’-CCCATACCCACCATCACAC C-3’，擴增片段長度為207bp，按照 PCR amplification kit說明進行反應，擴增條件:95℃預變性3min，94℃ 40s，54℃ 40s，72 ℃3min，循環 35 次，最后72℃3min。ERK2 cDNA引物序列上游引物為5’-ACCTCAAGCCTTCCAA CCTCC-3’，下游引物為 5’-CAGAGCCTG TTCAACTTCAATCC-3’，擴增片段長度為479bp，按照PCR amplification kit說明進行反應，擴增條件:95℃預變性3min，94℃ 20s，54℃ 30s，72℃ 3min，循環35 次;最后72℃3min;CaMKIIβ cDNA引物序列上游引物為5’-ATGTATCTCGCCTCCAAGCCTCT-3’，下游引物為 5’-GCACTCCTACCATCAAACCC TCAC-3’，擴增片段長度為413bp，按照PCR amplification kit說明進行反應，擴增條件:95℃預變性 3min，94℃ 40s，54℃ 40s，72℃ 3min，循環30次;最后72℃3min。用瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產物，以 β-actin為內參照，凝膠分析軟件Quantity one進行半定量分析。

2 結果

2.1 補陽還五湯對大鼠游泳路徑的影響 模型大鼠水迷宮運動軌跡呈4個象限均衡分布，而假手術組，補陽還五湯組和尼莫地平組大鼠運動軌跡主要集中在平臺象限(見圖1)。各組大鼠(假手術組、補陽還五湯組、尼莫地平組和模型組大鼠)平臺象限游泳的時間/游泳總時間分別為0.38±0.09、0.35 ±0.07、0.33 ±0.06、0.12 ±0.03，平臺象限游泳距離/游泳總距離分別為 0.37 ±0.07、0.36 ±0.08、0.33 ±0.05、0.18 ± 0.04，模型組均顯著小于假手術組(P＜0.05)，而補陽還五湯組和尼莫地平組均大于模型組 (P＜0.05)。補陽還五湯和尼莫地平組之間差異無顯著(P＞0.05)(見圖2)。

2.2 高頻刺激(HFS)對各組大鼠海馬CA1區LTP的影響 各組大鼠海馬在給予HFS前的基礎對照值(baseline)之間沒有明顯差異(見圖4)。給予HFS后，假手術組，補陽還五湯組和尼莫地平組和模型組大鼠的EPSP斜率百分比分別為154.18%±6.78%、147.23% ± 7.55%、143.91% ± 8.09%、121.33% ±6.45%，各組大鼠的 EPSP斜率百分比均有增強，說明了HFS成功地誘導出穩定的LTP。但模型大鼠EPSP的斜率百分比顯著弱于假手術組大鼠(P＜0.05);而補陽還五湯和尼莫地平組EPSP的斜率百分比較模型組顯著升高(P＜0.05)。補陽還五湯組和尼莫地平組大鼠相比EPSP斜率無明顯差異(P ＞0.05)(見圖3、圖4)。

2.3 補陽還五湯對血管性癡呆大鼠海馬組織ERK2與CaMKIIβ mRNA表達的影響 與假手術組比較，模型組大鼠海馬ERK2與CaMKIIβ mRNA表達均顯著減少(P＜0.05)，而補陽還五湯組和尼莫地平組ERK2與CaMKIIβ mRNA表達則明顯高于模型組(P＜0.05)，且兩組相比無顯著差異(P＞0.05)(見圖5、圖6)。

圖1 各組大鼠游泳軌跡圖

圖2 各組大鼠象限游泳距離和時間比值的比較

圖3 高頻刺激對各組大鼠海馬CA1區LTP的影響

圖4 記錄20min基礎電流后，給予高頻刺激誘導LTP產生

圖5 術后30d補陽還五湯對大鼠海馬組織ERK2 mRNA表達的影響

圖6 術后30d補陽還五湯對大鼠海馬組織CaMKIIβ mRNA表達的影響

3 討論

補陽還五湯是益氣活血中藥中的經典方劑，由黃芪、當歸尾、芍藥、川芎、桃仁、紅花、地龍組成，具有補氣、活血、通絡功效，給予補陽還五湯治療后大鼠平臺象限游泳的時間和距離與總游泳時間和總距離之比補陽還五湯組大鼠均顯著大于模型組，表明補陽還五湯可顯著改善大鼠學習記憶能力。用以防治缺血性腦血管病，從而改善學習記憶功能［5，6］。

長時程增強(LTP)是記憶的分子機制之一［4］，本實驗中通過記錄興奮性突觸后電位(EPSP)的變化以及大鼠海馬組織ERK2與CaMKIIβ mRNA表達，以了解補陽還五湯對血管性癡呆大鼠學習記憶的影響及其對海馬神經元突觸可塑性的影響。學習記憶的神經生物學基礎是神經細胞之間的聯系結構突觸的可塑性變化，大腦邊緣系統海馬結構作為學習記憶的關鍵部位，是一個具有可塑性的腦區。而LTP被認為是研究學習和記憶的神經元可塑性的最好的模型［10］。LTP的形成是突觸前后機制共同作用的結果，與突觸前神經遞質釋放、突觸后相關受體的Ca2+通道、蛋白激酶、逆行信使、即早基因等關系密切。現已經明確，CaMKII是突觸后致密區(PSD)的重要組成部分，可占PSD總量的30% ～50%，同時ERK2也參與突觸后膜的構建。該實驗研究表明給與補陽還五湯治療后ERK2與CaMKIIβ mRNA表達明顯上調，基因表達上調可使轉錄翻譯水平加強，從而使蛋白表達增多，從而促進了突觸后膜的構建［5］。突觸后膜的構建使LTP電活動增強，而LTP的增強同時也促進了基因的表達，研究表明，利用基因敲除技術，將CaMKII的α亞單位敲除，發現小鼠空間認知缺乏，海馬腦片的LTP誘導也受到損傷［11］并且降低 LTP幅度 50%左右，殘余的 LTP是CaMKIIβ的功能［12］，也有力支持本實驗結果。同時補陽還五湯組大鼠LTP較模型組大鼠EPSP斜率明顯上升，表明補陽還五湯可明顯增強突觸可塑性，促進LTP表達，提高其學習記憶能力。

總之，補陽還五湯在提高VD大鼠海馬CA1區LTP的EPSP斜率，與其在行為學上改善VD大鼠學習記憶能力一致。由此我們可以推斷補陽還五湯可以通過增強ERK2、CaMKII基因表達，增強神經元突觸可塑性，促進LTP表達，從而改善VD大鼠學習記憶能力，兩者是相輔相成，互為因果。我們將在下一步的試驗中對補陽還五湯的作用靶點做進一步研究。

［1］Bliss TV，Lomo T.Long-lasting potentiation of synaptic transmission in the dentate area of the anaesthetized rabbit following stimulation of the perforant path［J］.J Physiol，1973，232(2):331-356.

［2］Wang JH，Ko GY，Kelly PT.Cellular and molecular bases of memory:synaptic and neuronal plasticity［J］.Clin Neurophysiol，1997，14(4):264-293.

［3］Morris RG.Elements of a neurobiological theory of hippocampal function:the role of synaptic plasticity，synaptic tagging and schemas［J］.Eur J Neurosci，2006，23(11):2829-2846.

［4］Bliss TV，Collingridge GL.A synaptic model of memory:Long-term potentiation in the hippocampus［J］.Nature，1993，361(6407):31-39.

［5］唐敬龍，高維娟，李玉明，等.補陽還五湯對血管性癡呆大鼠海馬組織ERK2與CaMKIIβ蛋白表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2010，26(9):1722-1727.

［6］唐敬龍，錢 濤，高維娟，等.補陽還五湯對血管性癡呆大鼠行為學和海馬CA1區神經元形態學影響［J］.承德醫學院學報，2010，27(1):1-3.

［7］李 君，路國兵，高維娟，等.補陽還五湯對血管性癡呆大鼠海馬NR2B蛋白及其mRNA表達的影響［J］.中國行為醫學與腦科學雜志，2010，19(5):401-404.

［8］李 君，路國兵，高維娟，等.補陽還五湯對血管性癡呆大鼠海馬GluR1蛋白及mRNA表達的影響［J］.中國病理生理雜志，2010，26(5):901-906.

［9］Schmidt-Kastner R，Paschen W，Ophoff BG，et al.A modified fourvessel occlusion model for inducing in complete forebrain ischemia in rats［J］.Stroke，1989，20(7):936.

［10］Gruart A，Munoz MD，Delgado-Garcia JM.Involvement of the CA3-CA1synapse in the acquisition of associative learning in behaving mice［J］.J Neuroscience，2006，26(4):1077-1087.

［11］Giese KP，Fedorov NB，Filipkowski RK，et al.Autophosphorylation at Thr-286 of the alpha calcium-calmodulin kinaseII in LTP and leaming［J］.Science，1998，279(5352):870-873.

［12］廖素群.鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶II與記憶［J］.生物學教學，2004，29(7):1-3.