部分性發(fā)作癲癇相關SCN1A基因M145fsX148突變體的構建及亞細胞定位

羅金杰， 李文斌， 湯 斌， 廖衛(wèi)平

癲癇是一種大腦神經元異常放電引起的慢性腦功能障礙綜合征。國際抗癲癇聯(lián)盟委員會(ILAE)在1981年制定的癲癇發(fā)作分類方案將癲癇分為部分性發(fā)作、全面性發(fā)作及不能分類的癲癇發(fā)作［1］。前者約占所有癲癇病例的60%以上，因此其研究有很高的臨床意義。在目前已發(fā)現(xiàn)的15種癲癇相關基因中，編碼電壓門控鈉離子通道α1亞單位的SCN1A基因是與部分性發(fā)作癲癇發(fā)病相關的最重要的基因之一［2］。

SCN1A基因編碼鈉離子通道α1亞單位，其突變可異化通道蛋白的正常結構和功能，造成中樞神經系統(tǒng)電活動的失衡，誘發(fā)異常放電，最終引發(fā)部分性發(fā)作。國內外報道的與癲癇相關的SCN1A基因突變類型有300余種［3］。其不同的突變形式和突變位置可導致不同的癲癇發(fā)作類型［4］.。

本課題組在一個部分性發(fā)作癲癇患者中發(fā)現(xiàn)了SCN1A基因M145fsX148截斷突變，迄今國內未見報道［5］。我們以該突變?yōu)檠芯繉ο螅瑯嫿ǔ鰯y帶黃色熒光蛋白(YFP)的SCN1A基因截斷突變質粒，轉染人類神經母細胞瘤株SH-SY5Y，觀察其蛋白的亞細胞定位，以探討此截斷突變與癲癇間的關系。

1 材料與方法

1.1 材料 pCMV-SCN1A質粒由美國Alfred L.George教授惠贈，其含有正常人SCN1A基因全長編碼cDNA。人類神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞由本實驗室保存。Taq DNA聚合酶購于TaKaRa公司;DNA Marker購自于廣州東盛生物科技有限公司;DNA凝膠回收試劑盒和質粒小量抽提試劑盒購自東盛生物;快速限制性內切酶和T4連接酶購自Fermentas公司。轉染試劑LipofectamineTM2000和染料FM4-64FX購自Invitrogen公司。

1.2 截斷突變質粒的構建以及激光掃描共聚焦顯微鏡觀察的方法

1.2.1 M145fsX148突變體的構建 利用PCR技術，從含有正常人SCN1A基因全長編碼序列的質粒pCMV-SCN1A擴增獲得M145fsX148突變片段。該片段丟失了SCN1A基因3號外顯子433位點上的A堿基和434位點上的T堿基。以質粒pCMVSCN1A為模板，進行PCR特異性擴增。引物序列:上 游 引 物 5’-TTTGCGGCCGCATGGAGCAAACATCTAGATTTTAGATCTGTGCTTGTACCACCAGGA-3’，下游 5’-TTTGTCGACTTACTCATTGTCAAACACACAGTTTGTCAA-3’，分別在上下游引物中引入了SalⅠ和NotⅠ的酶切位點和保護性堿基。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系和參數(shù)為:總體系 50μl，10X Taq buffer 5μl，2mmol/μl dNTP 4μl，上下游引物(10pmol/μl)各2μl，模板 SCN1A 1μl，Taq 酶 0.25μl，dd H2O 36μl。反應條件:94℃預變性 2min;然后 94℃ 30s，58℃30s，72℃ 1min;35 個循環(huán)，最后 72℃ 延伸 10min。PCR產物經凝膠回收后純化得到大小為433bp的SCN1A截斷突變序列。之后與質粒pCMV-SCN1A分別用SalⅠ和 NotⅠ進行雙酶切，酶切產物凝膠回收后，用T4快速連接酶在4℃鏈接15min。將連接反應產物轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞TOP10，用含卡那霉素的平板篩選，擴增，提取質粒。質粒行雙酶切鑒定和DNA測序，證實截斷突變質粒pCMV-MuSCN1A構建成功。

1.2.2 攜帶黃色熒光蛋白的SCN1A截斷突變質粒pCMV-YFP-MuSCN1A的構建 通過PCR擴增得到黃色熒光蛋白YFP基因序列，上游引物P1:5’-CGCTCTAGAGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’，含 Xbal I酶切位點;下游引物 P2:5’-GTCAGATCTCAGCTCGTCCTTCTTGA-3’，有Bgl II酶切位點。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。用同樣的方法進行PCR擴增，純化回收目的片段。再將得到的YFP片段和已獲得的SCN1A基因截斷突變質粒pCMV-MuSCN1A分別用Xbal I和Bgl II酶切，瓊脂糖凝膠回收YFP片段和載體。然后將二者以T4 DNA連接酶進行連接，轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞TOP10，在含卡那霉素平板上篩選、擴增，以堿裂解法小量提取質粒。通過酶切鑒定和DNA測序驗證，YFP片段位于截斷突變質粒N端第9和10個堿基之間［6］，最終獲得攜帶黃色熒光蛋白的SCN1A基因截斷突變質粒pCMV-YFP-MuSCN1A。

1.2.3 人類神經母細胞瘤株SH-SY5Y細胞的培養(yǎng)及轉染 采用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基，在37℃，5%CO2條件下細胞培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的SH-SY5Y細胞，以1×105個細胞/皿的密度接種于24孔板進行爬片。當細胞生長融合至60% ～75%左右時，使用LipofectamineTM2000試劑盒將突變質粒pCMV-YFP-MuSCN1A和熒光真核表達載體 pECFP-ER各0.4μg共轉染至SH-SY5Y細胞中。48h后觀察轉染質粒的表達情況。

1.2.4 激光掃描共聚焦顯微鏡觀察SCN1A基因M145fsX148截斷突變編碼的蛋白在SH-SY5Y細胞內的定位 使用染料FM4-64FX將轉染后的細胞染色，采用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察熒光的表達。

2 結果

2.1 PCR擴增產物及質粒構建體的鑒定 以pCMV-SCN1A質粒為模板，用設計的引物進行PCR擴增，所得特異性條帶與預期長度為433bp的目的基因相符(見圖1)。該基因序列433-434位點上丟失AT兩個堿基。將所得截斷突變質粒pCMV-YFPMuSCN1A用SalⅠ和 NotⅠ進行雙酶切鑒定，1% 瓊脂糖凝膠電泳檢測，可得到1111bp大小的片段(M145fsX148突變片段433bp+YFP片段678bp)和4214bp大小的載體片段，與理論預計相符 (見圖2)。進一步將此重組質粒進行測序鑒定，DNA測序結果表明pCMV-YFP-MuSCN1A質粒丟失SCN1A基因3號外顯子433-434位點上的AT堿基，提前形成終止密碼子，其他序列未發(fā)生改變(見圖3)。

2.2 SCN1A基因截斷突變質粒在SH-SY5Y細胞中的亞細胞定位 轉染后的細胞用markerFM4-64染色，其細胞膜在激光共聚焦顯微鏡下發(fā)紅色熒光。用發(fā)藍色熒光的pECFP-ER來標記內質網。激光掃描共聚焦顯微鏡顯示，SH-SY5Y細胞中黃色熒光主要位于細胞質中，表示攜帶黃色熒光蛋白的SCN1A基因截斷突變質粒主要在細胞質中表達(見圖4)。

圖1 PCR擴增M145fsX148突變片段

圖2 pCMV-YFP-MuSCN1A酶切鑒定結果

圖3 pCMV-YFP-MuSCN1A質粒測序圖

3 討論

電壓門控型鈉通道是一種能激活神經系統(tǒng)去極化的膜蛋白，鈉通道由一個α亞單位和兩個β亞單位組成，其中α亞單位作為主體形成通道孔，是鈉離子通道的主要組成部分，主要在細胞膜上發(fā)揮功能［7］。α1亞單位含有2000個氨基酸，由4個高度同源的結構域組成，每個結構域含有6個跨膜區(qū)域，C端和N端直接朝向細胞內部，其編碼的蛋白在細胞膜上表達［8］。編碼鈉離子通道 α1亞單位的SCN1A基因是癲癇的主要致病基因之一。80%SMEI由SCN1A基因突變引起，這些突變中一半是截斷突變［9］。后者可引起轉錄和翻譯的異常，使相應的離子通道蛋白表達減少或缺如。這些離子通道蛋白結構的改變導致離子通道的電流增加或減少均可引起癲癇發(fā)作［10］。Ogiwara等人的研究發(fā)現(xiàn)SCN1A基因R102X截斷突變編碼的異常蛋白不能在轉基因小鼠神經細胞的細胞膜上表達，引起鈉離子通道功能的改變，導致癲癇的發(fā)生［11］。以往的研究顯示Na1.2的C末端451個氨基酸可能通過與神經細胞特異因子相互作用將 Na1.2定位到軸突［12］。這提示我們鈉離子通道的C末端與鈉通道的亞細胞定位相關。當C端序列丟失后則可能干擾了相關蛋白的遷移，進而影響鈉通道的功能。

本實驗室在部分性發(fā)作癲癇患者中首先發(fā)現(xiàn)了SCN1A基因框移突變 M145fsX148，位于 Domain I的SI［5］。它是在3號外顯子433和434的位置丟失兩個堿基，導致堿基重排，形成終止密碼子，提前終止蛋白翻譯，從而引起被編碼的蛋白C末端大部分區(qū)域丟失。我們利用基因重組技術構建了SCN1A基因M145fsX148突變體的真核表達載體。將黃色熒光蛋白(YFP)插入到該截斷蛋白N端的第3個和第4個氨基酸之間，使YFP的編碼序列對離子通道蛋白的結構和亞細胞定位影響減到最小［6］。將其轉染入SH-SY5Y細胞，激光掃描共聚焦顯微鏡顯示異常的SCN1A蛋白主要在細胞質中表達，而未在膜上表達。證實該突變干擾了鈉通道蛋白的分選、遷移和定位過程，進而改變鈉通道的功能引起疾病。

由于SCN1A基因突變形式復雜多樣，直接在人體內研究或在眾多的突變動物模型進行研究亦不現(xiàn)實，且不經濟。因此體外構建轉染細胞體系進行蛋白功能研究非常重要。目前國內缺乏對SCN1A基因截斷突變功能研究的相關報道。我們構建了pCMV-YFP-MuSCN1A真核表達載體，為進一步研究SCN1A基因截斷突變導致I型電壓門控鈉離子通道功能的變化奠定了基礎，也為作用于鈉離子通道的抗癲癇藥物的研發(fā)提供了廣闊前景。

圖4 重組質粒pCMV-YFP-MuSCN1A與藍色熒光定位載體pECFP-ER共轉染SH-SY5Y細胞

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