大鼠骨髓基質干細胞體外誘導分化為神經元樣細胞相關基因研究

閆西剛， 貢志剛， 張榮俊， 蘭 青

近年來對BMSCs體外誘導分化的研究已經取得了極大的進展，但有關分化機制的許多問題仍沒有解決，特別是有哪些基因參與了誘導分化的調控，每種基因在調控中起到何種作用等一系列問題仍沒有得到解決。為了在基因水平上進一步研究BMSCs誘導分化的機制問題，本實驗借助Affymetrix基因芯片對BMSCs分化過程中的基因表達情況進行研究，試圖找出與神經元分化密切相關的基因，一方面從分子水平驗證其向神經元分化的能力;另一方面也為BMSCs的基因工程改造提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 動物與材料 動物:成年近交系Wistar大鼠(＞36代)，雌雄不限，體質量約300克/只(中國科學院上海實驗動物中心提供)。試劑:DMEM(Gibco公司)、F12(Gibco公司)、胎牛血清(FBS，杭州四季青公司)、淋巴細胞分離液(密度為1.077g/L，上海試劑二廠)、堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor bFGF，Sigma公司)、表皮生長因子(epidermal growth factor EGF，Peprotech公司)、山羊血清(PAA公司)、Triton-X-100(Sigma公司)、聯脒二苯吲哚(DAPI，Sigma公司)、兔抗CD44抗體(武漢博士德生物工程有限公司)、小鼠抗兔CD45單克隆抗體(Caltag公司)、兔抗β-Tubulin III抗體(Corance公司)、兔抗GFAP抗體(DAKO公司)、Alexa Fluor 488標記羊抗兔IgG(Molecular Probes公司)、Cy3標記羊抗小鼠IgG(Dianova公司)。儀器:CO2細胞培養箱(ESPEC BNA-311)、倒置相差顯微鏡(XDS-1B)、激光共聚焦顯微鏡(Ziess LSM410);Affymetrix U133 plus 2.0基因表達譜芯片(上海生物芯片有限公司提供)。

1.2 方法

1.2.1 關于BMSC BMSC的取材、細胞培養、誘導分化及免疫細胞化學鑒定詳見文獻報告［1］。

1.2.2 總RNA的提取和基因芯片雜交 按Trizol試劑盒說明采用一步法從組織樣本中抽提總RNA，RNeasy Mini Kit進行純化。抽提的 RNA用1%的DEPC溶解后在紫外分光光度儀下測定RNA的濃度和純度，同時凝膠電泳檢測RNA有無降解。按Super-ScriptⅡ試劑盒操作說明反轉錄成cDNA，然后用RNA轉錄標記試劑盒進行轉錄合成cDNA探針，合成的同時進行生物素標記;生物素標記的cDNA探針經片段化處理后與基因芯片(Affymetrix Rat Expression Array230 2.0)在雜交爐 640中45℃雜交16h，然后于基因芯片流程工作站400中洗脫、染色。最后用GeneArray掃描儀掃描雜交信號。

1.2.3 芯片數據處理 雜交后的芯片經Gene array Scanner3000 7G掃描儀讀取數據點后計算得出一個顯著性P值。采用GCOS軟件比較計算兩張芯片上同一探針的信號值得到顯著性差異P值，根據統計學定義，P值差異在0～0.002之間的，認為基因表達為上調(Increase I);在0.998 ～0.999 之間的認為是表達下調(Decrease D);0.003～0.997之間的認為該基因的表達量在所比較的兩張芯片實驗結果中沒有變化(No Change NC);位于兩個區間0.002～0.003和0.997 ～0.998 內的屬于臨界狀態(Marginal Increase MI;Marginal Decrease MD)。進一步結合另2個嚴格標準，最終可靠地篩選出上調(Up)和下調(Down)基因。上調(Up)或下調(Down)需同時滿足以下3個標準，上調(Up):Signal Log Ratio＞ =1，實驗組 Detection為 P，Change為I或 MI;下調(Down):Signal Log Ratio＜ = －1，對照組Detection為 P，Change為 D 或 MD(注:Signal是掃描儀檢測出的光強度經過Normalize后的數據;Detection分為P、A和M 3種，P代表Present，A代表Absent，M代表Marginal;Signal Log Ratio指實驗組和對照組比值取Log2后的值)。

2 結果

2.1 BMSCs的培養、傳代 原代的BMSCs呈貼壁生長，細胞生長緩慢，形態多樣，胞體呈梭形、橢圓形、三角形、不規則形。傳至第3代時，細胞形態趨于一致，大部分細胞呈長梭形，細胞密集生長處呈現旋渦狀、菊花狀、輻射狀。傳代后的細胞生長迅速，3～4d即可長滿瓶底。至3代以后，細胞形態趨于一致。

2.2 BMSCs免疫表型鑒定 CD44抗原是BMSCs表面標志性抗原之一，免疫細胞化學熒光染色顯示，BMSCs經CD44抗體染色后可見大量呈綠色的CD44陽性細胞。第四代BMSCs的CD44陽性率最高為(95.23 ±3.06)%。

2.3 BMSCs的誘導分化 BMSCs誘導72h后，大部分細胞發生形態改變，伸出類似神經元樣的突起，突起之間相互連接，形成廣泛的網絡樣結構。4d后細胞發生形態改變的趨勢減緩，7d后幾乎已無細胞發生形態改變。

2.4 BMSCs誘導分化后的免疫細胞化學鑒定分別對誘導1～7d的細胞行幼稚神經元標記物β-TubulinIII、星形膠質細胞標記物GFAP染色，發現隨著誘導時間的延長β-TubulinIII陽性細胞以及GFAP陽性細胞數逐漸增加，至第7天時達到最高，分別為(75.43 ±7.63)%和(33.01 ±6.73)%。

2.5 Scatter散點圖 芯片雜交后的掃描圖。其中散點圖的X軸為對照組的信號值，Y軸為實驗組的信號值，圖中紅色的點為實驗組和對照組該基因的Detection均為P，藍色的為兩組中有一個值不是P的，而黃色的點為兩組均為A。散點圖中共有8條斜線，它們由上往下為 30、10、3、2、－2、－3、－10、－30，篩選出來的差異基因應該在2和－2線外。

2.6 芯片檢測結果 實驗得到0d，7d兩張基因芯片。在0d和7d的芯片表達譜中共發現差異基因97條(本文不具體列出)，其中上調基因62條，下調基因35條。通過文獻檢索，發現有24條基因與神經元發育相關，其中經誘導后表達上調的基因有18條(見表1)，表達下調的有6條(見表2)。

表1 BMSCs誘導后表達上調的與神經元發育相關的基因

表2 BMSCs誘導后表達下調的與神經元發育相關的基因

3 討論

BMSCs是存在于骨髓中除造血干細胞外的另一種干細胞。近年來的研究顯示，BMSCs可在體內、體外誘導成為神經元樣細胞［2］，并能增殖和具有神經細胞的一些功能，加之其來源豐富，取材簡便，易于分離純化培養，在一定條件下可在體外迅速擴增，且自體移植克服了倫理和免疫排斥的問題［3］，因此有望成為神經系統疾病的細胞替代療法和基因治療的載體［2］。但它同樣也面臨著許多棘手的問題。BMSCs定向分化為神經元樣細胞的過程比較復雜，其多潛能性決定了它的分化調控機制的復雜性，如何弄清其分化機制問題，以便我們通過人工干預的手段促使其更好的向神經元方向分化，是我們亟待解決的問題?；蛐酒某霈F為解決這些難題提供了新的思路。本實驗利用基因芯片技術對BMSCs分化過程中的基因表達譜進行分析。通過分析，我們發現在0d和7d的芯片表達譜中共有差異基因97條，其中上調基因62條，下調基因35條。這些基因中有24條基因功能相對單一且與神經元發育密切相關。我們挑選了部分重要的差異表達基因，現將這些基因的最新研究以及它們與神經元的關系進行簡單的闡述。

Noggin基因在胚胎發育和神經系統的成熟過程中起到重要作用，其神經誘導功能主要與其對骨形態形成蛋白(BMP)的抑制作用有關［4］。Noggin與BMP2/BMP4的親和性較高，可阻滯BMP2/BMP4與其相應的受體結合，抑制BMPs受體信號通路，從而誘導神經細胞的形成。小鼠胚胎干細胞的誘導分化實驗證實，Noggin與BMP4可調控胚胎干細胞向神經元的分化，還可調控成年神經干細胞的增殖與分化，抑制Noggin基因轉錄可降低神經干細胞的增殖［5］。Noggin參與調節成年神經干細胞向神經膠質細胞形成和神經元形成之間的平衡，調節學習和記憶的過程。這都表明Noggin具有重要的神經誘導功能。我們實驗中Noggin在BMSCs誘導分化后高表達進一步證實了其在BMSCs向神經元分化過程中扮演著很重要的角色。BMP4(bone morphogenetic protein 4，骨形態形成蛋白)在神經系統發育的不同時期、不同部位均起著重要的作用。其在啟動BMSCs分化過程中發揮重要作用，主要表達于神經前體細胞，對神經前體細胞具有誘導其增殖和分化的作用。有報道表明在干細胞分化過程中，BMP4即可以促進神經元的分化，也可以促進神經膠質細胞的分化，其在胚胎發育第13d天時促進神經元的分化，在17d時促進膠質細胞的分化［6］。在神經元分化的中后期，其促進膠質細胞分化的功能受到Noggin基因抑制，從而促進了BMSCs向神經元方向分化。Rtn1基因是漿膜蛋白家族的成員，在具有神經內分泌性質的細胞中高度表達，因此被稱為神經內分泌特異蛋白(neuroendocrine specific protein，NSP)［7］。其已被證實與神經系統內分泌密切相關，其編碼的蛋白質-漿膜蛋白對神經元的增殖和分化起到重要的作用。MAP2(microtubule-associatedprotein 2，微管相關蛋白2)是神經元特異性微管相關蛋白，有穩定神經元微管和保持神經元形態的作用，是突起胞漿的重要組成部分，位于神經元的胞體和樹突，其對BMSCs誘導后細胞形態的改變及保持神經元的功能起到重要作用。此外，MAP2是樹突中主要的PKA(cAMP-dependent protein kinase)錨定蛋白，MAP2缺失，引起大腦皮層及海馬神經細胞樹突中PKA量減少，由于PKA量的減少，PKA底物之一CREB(cAMP-responsive element binding protein)的磷酸化發生異常，從而導致神經細胞信號轉導出現異常。因此，MAP2除了有穩定神經元微管和保持神經元形態的作用外，在調節PKA的量、控制誘導CREB的磷酸化，即神經細胞信號轉導方面也起著重要的作用。Numb基因主要分布在分裂中的神經上皮中的頂部皮層，在神經上皮皮層垂直分裂的時候，Numb基因起抑制分化的作用并維持神經上皮狀態［8］，另有研究表明Numb基因為參與神經干細胞定向分化過程的基因之一［9］。本實驗中Numb基因在BMSCs向神經元樣細胞分化后表達下降，這與該基因的分子生物學特性相符合，BMSCs未分化前大部分細胞維持干細胞狀態，Numb基因高表達，BMSCs經誘導后向成體神經元樣細胞轉化，Numb基因的表達量有所下降。

綜上所述，本實驗通過對BMSCs誘導分化前后基因表達譜的分析，發現了部分與神經元分化相關的差異表達基因，一方面進一步支持了BMSCs可以向神經元方向轉化的理論;另一方面深化了對BMSCs向神經元分化相關分子機制的理解。在后續的實驗中我們將行RT-PCR及Western Blot對篩選出的差異表達基因進行進一步的驗證及研究，以便我們通過人工干預的手段促使其更好的向神經元方向分化，為基因工程改造利用BMSCs奠定扎實的基礎。

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