p38 MAPK在大鼠腦缺血再灌注腦組織AQP4表達變化及腦水腫形成中的作用

王耀輝， 李國輝

腦缺血再灌注后腦水腫是缺血性腦卒中重要的病理過程，同時也是治療缺血性腦卒中的關鍵，然而目前對腦缺血再灌注后腦水腫發生機制尚不完全清楚。水通道蛋白4(AQP4)廣泛分布于中樞神經系統，在腦水腫的病理生理變化中發揮著重要的作用［1］。絲裂原激活蛋白激酶(MAPK)信號通路是生物體內重要的信號轉導系統，參與介導細胞生長、發育、分裂和分化等多種病理生理過程［2］。作為MAPK家族的一員，p38可在多種(缺血再灌注損傷、滲透壓變化和生理應激等)病理生理條件下激活［3］，是腦組織損傷等病理改變的重要信號通路［4］。研究顯示［5］，在液壓沖擊模型阻中，通過抑制p38磷酸化，可以降低星形膠質細胞AQP4的表達及細胞水腫程度。但p38 MAPK是否在腦缺血再灌注后腦組織AQP4表達及腦水腫形成中也發揮作用，國內外尚未見報道。本研究旨在觀察大鼠腦缺血再灌注后腦組織磷酸化p38(p-p38)的水平，抑制p38的激活能否降低此過程腦組織AQP4的過表達及腦水腫程度，探討其作用的機制。

1 材料和方法

1.1 主要藥品和試劑 兔抗大鼠p38多克隆抗體、p-p38多克隆抗體及AQP4多克隆抗體(Santa Cruz)。羊抗兔IgG(北京中杉金橋)。p38特異性抑制劑SB203580(Selleck)。

1.2 實驗動物分組和給藥 SPF級雄性SD大鼠54只(體質量240～260g)，由廣西醫科大學實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(桂)2009-0002。隨機分成3組:假手術組(sham組，n=18只)、缺血再灌注組(I/R組，n=18只)和p38抑制劑組(SB組，n=18只)。I/R組和SB組分別在制備大腦中動脈缺血/再灌注(MCAO/R)模型前15min通過舌下靜脈注射10%DMSO(400μg/kg)和 p38抑制劑(SB203580，400μg/kg)。各組大鼠均于再灌注24h神經癥狀缺損評分后處死大鼠進行相關指標測定。

1.3 大鼠腦缺血再灌注模型的制備 改良大鼠大腦中動脈缺血/再灌注(MCAO/R)模型的制備:腹腔注射10% 水合氯醛(0.30ml/100g)麻醉大鼠，于左側頸總動脈(CCA)分叉處分離頸外動脈(ECA)及頸內動脈(ICA)。雙極電凝器凝斷ECA及其分支，游離ECA主干，用眼科剪于ECA的遠心端斜行45°剪一倒“V”小口并導入栓線。導入深度19～22mm，栓線頭端恰好堵塞大腦中動脈(MCA)開口。術后2h拔出栓線，完成MCAO/R模型。假手術組:不做腦梗死，栓線插入深度＜9mm。若因造模失敗或動物死亡等原因導致某實驗組數目不足，通過隨機抽樣原則補齊動物數目。

1.4 大鼠神經功能缺損評分 大鼠腦缺血再灌注24h后，對其進行神經功能缺損評分。參照Zea-Longa法［6］:無神經功能缺損癥狀評0分;對側前爪不能完全伸展評1分;向對側轉圈評2分;向對側傾倒評3分;不能自發行走且意識水平下降評4分。造模成功的標志:大鼠麻醉蘇醒后出現以前肢為重的缺血對側肢體的偏癱即神經功能缺損評分1～3分并且斷頭取腦后大腦中動脈無出血或血管內血栓形成。

1.5 腦組織含水量測定 大鼠腦缺血2h再灌注24h，麻醉后快速取腦，將腦組織放在墊有生理鹽水浸濕濾紙的培養皿中。電子天平稱濕重，然后將腦組織置于100℃恒溫干燥箱中，烘干24～48h至恒重是為干重。計算含水量:腦含水量(BWC)=(濕重－干重)/濕重×100%。

1.6 Western blot檢測腦組織 p-p38、p38 和AQP4的表達 大鼠腦缺血2h再灌注后24h，麻醉并迅速取腦，于冰上切取缺血周邊區皮層腦組織，置于液氮中快速冷凍，－70℃保存待用。提取總蛋白后，制備SDS-PAGE凝膠，加樣電泳。濕轉法將蛋白條帶轉移至PVDF膜上，置入封閉液中(5%脫脂奶粉)常溫封閉1h，封閉后加一抗(p38 1∶1000，p-p38 1∶1000，AQP4 1∶300)，4℃孵育過夜，加入 HRP 標記的二抗(羊抗兔 IgG，1∶1000)，37℃孵育1h，ECL 曝光、顯影及定影，以β-actin作為內參。光片掃描后用Quantity One軟件分析吸光度，p-p38/p38的吸光度比值A為p-p38的表達水平，AQP4/β-actin的吸光度比值A為AQP4的表達水平。

1.7 統計學處理 采用SPSS 19.0進行統計分析，計量資料采用均數±標準差()表示，神經功能缺損評分比較采用秩和檢驗，其余組間比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 神經功能缺損評估 與sham組相比，I/R組、SB組大鼠腦缺血再灌注后神經功能缺損癥狀不同程度加重(P＜0.05)。與I/R組相比，SB組大鼠神經功能缺損癥狀有所改善(P＜0.05)(見表1)。

2.2 腦組織含水量 sham組大鼠腦組織有一定的含水量。與sham組相比，I/R組和SB組大鼠腦組織含水量明顯增加 (P＜0.05);與I/R組相比，SB組大鼠腦組織含水量明顯減少(P＜0.05)(見表1)。

2.3 Western blot結果 sham組大鼠腦組織中p-p38和AQP4均有少量表達;與sham組相比，I/R組大鼠缺血周邊區腦組織p-p38的水平明顯上升(P ＜0.05)，AQP4的表達也明顯上調(P ＜0.05);與I/R組相比，SB組大鼠缺血周邊區腦組織p-p38的水平明顯下降(P＜0.05)，AQP4的表達也明顯下調(P ＜0.05)(見表2)。

表1 各組大鼠腦缺血再灌注后神經功能評分及腦含水量(n=6，)

表1 各組大鼠腦缺血再灌注后神經功能評分及腦含水量(n=6，)

與sham組比較△P＜0.05;與I/R組比較*P＜0.05

組別 神經功能評分 腦含水量sham組I/R組SB組0 2.33 ± 0.16△1.72 ± 0.18*0.776 ± 0.007 0.817 ±0.012△0.792 ±0.010*

表2 各組大鼠腦缺血再灌注后腦組織AQP4和p-p38表達(n=6，)

表2 各組大鼠腦缺血再灌注后腦組織AQP4和p-p38表達(n=6，)

與sham組比較△P＜0.05;與I/R組比較*P＜0.05

組別 例數AQP4 p-p38 sham組I/R組SB組666 1.224 ± 0.144 2.660 ± 0.130△1.771 ± 0.092*0.648 ± 0.096 2.463 ± 0.138△1.653 ± 0.105*

3 討論

腦水腫是缺血性腦卒中重要的繼發性腦損害，直接影響缺血性腦卒中患者的預后，是臨床治療腦卒中的關鍵。所以，如何預防和治療缺血性腦卒中后腦水腫一直是臨床研究的熱點。

MAPK廣泛分布于細胞的胞漿內，是細胞各種生物學反應的重要信號傳導通路，它主要包括:p38、ERK1/2及JNK 3種亞家族成員。p38 MAPK可在多種(缺血再灌注損傷、滲透壓變化和生理應激等)條件下激活［3］，并在神經系統炎癥反應和細胞凋亡的調節中發揮重要作用［7，8］。Wallace 等［9］在大鼠腦缺血性卒中實驗模型中發現，抑制p38的激活可以有效降低腦水腫的程度。Nito等［10］在體外星形膠質細胞實驗中證實，抑制p38的激活可以降低星形膠質細胞AQP4的表達，減輕星形膠質細胞水腫的程度。

AQP4是維持腦組織水平衡的主要水通道蛋白，在腦內水平衡的調節中起到關鍵作用［11］。研究發現，在細胞毒性腦水腫模型中，敲除AQP4基因的大鼠與野生型大鼠相比，其星形膠質細胞足突腫脹及細胞毒性腦水腫的程度均明顯減輕［12］，而在AQP4基因過表達的大鼠細胞毒性腦水腫模型中，其顱內壓較野生型鼠明顯增高［13］。此外，在其他細胞毒性腦水腫模型研究中［14，15］，也進一步證實AQP4的高表達與細胞毒性腦水腫密切相關。p38 MAPK是否對大鼠腦缺血再灌注后腦組織中AQP4的表達及腦水腫的發生發展起到關鍵作用，目前國內外鮮見報道。

我們的研究發現，大鼠腦缺血再灌注后缺血周邊區腦組織中p-p38的水平明顯增加，AQP4表達亦增高，腦組織含水量增加，腦水腫程度加重。與腦缺血再灌注大鼠相比，在造模前預先給予p38特異性抑制劑(SB203580)的大鼠缺血周邊區腦組織中p38的磷酸化受到明顯抑制，AQP4表達水平亦降低，腦組織含水量減少，腦水腫程度減輕。我們推斷:由于腦缺血再灌注過程中p38 MAPK被激活，致使p-p38表達增高并介導其下游因子AQP4表達的上調，導致過多水分流入細胞內，腦水含量增多，腦水腫程度加重;p38特異性抑制劑抑制可抑制腦缺血再灌注過程中p38的過度激活，致使p-p38表達降低，進而有效下調AQP4的過表達，減少過多的水分流入細胞內，減輕腦水腫。

綜上所述，抑制p38 MAPK在大鼠腦缺血再灌注過程中的過度激活，可下調AQP4的高表達，減輕腦水腫的程度，說明p38 MAPK在調節腦缺血再灌注大鼠腦組織中AQP4表達及腦水腫過程中發揮重要的作用。此研究結果為腦缺血再灌注后腦水腫的機制和臨床靶點治療的探索提供了新的線索，但具體的防治措施及分子機制有待于進一步的實驗和研究。

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