粉碎及酶處理對啤酒糟理化特性的影響*

張麟，蔡國林，高獻(xiàn)禮，陸健，5

1(江南大學(xué)工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué)糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)3(啤酒生物發(fā)酵工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島，266023)4(江南大學(xué)生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122)5(宿遷市江南大學(xué)產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，江蘇 宿遷，223800)

啤酒糟(brewer’s spent grain，BSG)是啤酒生產(chǎn)過程中產(chǎn)量最大的副產(chǎn)品，是麥芽經(jīng)糖化后過濾剩余的濾渣，含有麥芽的外殼和殘留的胚乳，富含纖維素、阿拉伯木聚糖、木質(zhì)素和蛋白質(zhì)。干燥后的啤酒糟中纖維素含量在17%左右，非纖維素多糖(主要是阿拉伯木聚糖)含量在28%左右，木質(zhì)素含量在28%左右，粗蛋白含量在20%左右［1-3］，是一種潛在的蛋白質(zhì)飼料原料。2012 年我國年產(chǎn)啤酒4 902 萬kL，啤酒糟約500 萬t。雖然啤酒糟產(chǎn)量豐富，但現(xiàn)階段尚未實(shí)現(xiàn)啤酒糟的高值化利用，大部分啤酒廠以低價(jià)格出售，用作反芻動物的飼料;還有部分啤酒廠則直接當(dāng)廢棄物排放，不但浪費(fèi)了蛋白質(zhì)資源，還對環(huán)境造成了嚴(yán)重的影響［4-6］。

和優(yōu)質(zhì)蛋白飼料魚粉、豆粕相比，啤酒糟的蛋白含量低、蛋白質(zhì)不容易被消化、吸收，賴氨酸和精氨酸含量低，并且還存在大量抗?fàn)I養(yǎng)因子，如纖維素和半纖維素，影響動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用。為了提高啤酒糟的附加值，研究人員進(jìn)行了大量的探索，如以啤酒糟發(fā)酵制備酶制劑，添加微生態(tài)制劑制備發(fā)酵飼料［7］，液態(tài)酶解提取制備蛋白質(zhì)或多肽［8］等，由于啤酒糟結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生物利用度低，導(dǎo)致生產(chǎn)成本高，且存在市場容量等限制因素尚未實(shí)現(xiàn)大規(guī)模的生產(chǎn)應(yīng)用。本研究通過不同機(jī)械方法對啤酒糟進(jìn)行預(yù)處理，研究機(jī)械預(yù)處理對酒糟生物利用度的影響，同時(shí)，采用組分分級技術(shù)，將纖維素、蛋白質(zhì)初步富集分離，以期為后續(xù)的的全組分利用提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品

啤酒糟由青島啤酒上海松江有限公司提供。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)所用主要試劑

中性蛋白酶(MAXAZYME NNP DS)、纖維素酶(Validase TRL)和木聚糖酶(BAKEZYME BXP 5001 BG)，由帝斯曼(中國)有限公司提供;NaOH、KOH、H2SO4、葡萄糖、木糖、CuSO4、K2SO4等，均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.1.3 儀器與設(shè)備

Q-150A3 刀片粉碎機(jī)，上海冰都電器有限公司;XQM-2L 實(shí)驗(yàn)行星球磨機(jī)，長沙天創(chuàng)粉末技術(shù)有限公司;H1850R 臺式高速冷凍離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司;KjeItec2300 凱氏定氮儀，瑞典FOSS分析儀器有限公司;UV-2100 紫外分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司;MICROTRAC S3500 激光粒度分析儀，美國Microtrac 公司。

1.2 啤酒糟的預(yù)處理

含水量為60%左右的啤酒糟經(jīng)過60℃干燥成為啤酒糟原樣。機(jī)械預(yù)處理方式為刀片粉碎和球磨機(jī)研磨，200 g 樣品刀片粉碎5 min，50g 樣品球磨處理3 min。

啤酒糟粉碎分級:經(jīng)過刀片粉碎的啤酒糟用60目篩篩分，獲得不能通過60 目篩(Max60)和能通過60 目篩(Min60)的2 個(gè)組分。

1.3 粒徑分布

粒徑分布的測定:MICROTRAC 激光粒度分析儀測定。

1.4 粗纖維含量

粗纖維含量的測定:按照GB/T 5009.10 -2003植物類食品中粗纖維的測定［9］。

1.5 粗蛋白含量

粗蛋白含量的測定:FOSS 全自動凱式定氮儀Kjeltec 2300 測定［10］。

1.6 多肽含量測定

參考GB/T22492 -2008 測定啤酒糟中肽的含量［11］。

1.7 還原糖、水溶性總糖測定

還原糖測定:采用DNS 比色法;總糖測定:采用硫酸-苯酚法測定總糖含量［12］。

1.8 水溶性蛋白濃度

水溶性蛋白濃度測定:采用考馬斯亮藍(lán)法測定水溶性蛋白濃度［13］。

1.9 酶解實(shí)驗(yàn)

纖維素酶解:500U 纖維素酶Validase TRL 用0.05 mol/L pH5.5 的檸檬酸緩沖液定容到250 mL 容量瓶中，取20 mL 稀釋酶液加入到0.5 g 樣品中，于37℃酶解1 h。

木聚糖酶解:1 000U 木聚糖酶BAKEZYME BXP 5001 BG 用0.1 mol/L pH5.5 的醋酸緩沖液定容到250 mL 容量瓶中，取20 mL 稀釋酶液加入到0.5 g 樣品中，于50℃酶解1 h。

中性蛋白酶酶解:10 000U 中性蛋白酶MAXAZYME NNP DS 用0.1 mol/L pH7.2 的磷酸緩沖液定容到250 mL 容量瓶中，取20 mL 加入0.5 g 樣品中，于40℃酶解1 h。

2 結(jié)果與討論

2.1 機(jī)械預(yù)處理對啤酒糟粒徑分布變化的影響

未經(jīng)機(jī)械處理的啤酒糟基本保持了麥芽的形狀，呈梭形、長8 ～12 mm、直徑3 ～4 mm。不同機(jī)械預(yù)處理后的酒糟樣品的粒徑分布如圖1 所示。從圖1(a)可以看出，經(jīng)過機(jī)械處理后酒糟顆粒明顯變小，刀片式粉碎的樣品主要粒徑分布集中在300 ～1 000 μm，而經(jīng)過球磨粉碎的酒糟，95%的粒徑小于490 μm，50%粒徑都小于120 μm，甚至達(dá)到了微米尺度。由于細(xì)小顆粒傾向于聚集在一起，因此測得的粒子大小的值可能比實(shí)際值偏大，經(jīng)過球磨的谷物糠麩顆粒集中在10 ～200 μm 的范圍內(nèi)分布。從圖1(b)可以看出，刀片粉碎過篩能通過60 目(Min60)的啤酒糟的粒徑主要分布在250 μm 范圍內(nèi)，且粒徑分布相對其他樣品比較集中。刀片粉碎過篩不能通過60 目(Max60)的啤酒糟粒徑分布在300 ～1 000 μm。通過機(jī)械預(yù)處理后，啤酒糟的粒徑減小，理論上酶接觸有效表面積增大，可以提高酶水解的效率。

圖1 不同預(yù)處理方式下啤酒糟樣品的粒徑分布(a)和刀片粉碎篩分后啤酒糟樣品的粒徑分布(b)Fig.1 Particle size distributions of BSG samples milled with different types of mills (a)and particle size distributions of BSG samples milled by blade grinding with different composition grading (b)

2.2 機(jī)械預(yù)處理對啤酒糟粗纖維含量變化的影響

機(jī)械處理對酒糟粗纖維含量的影響如圖2 所示，可以看出機(jī)械預(yù)處理后粗纖維含量降低約34%，但刀片粉碎和球磨研磨之間的差異不明顯。機(jī)械處理過程中的剪切力和摩擦力將纖維素撕扯得更小，而半纖維素對熱是最為敏感的［14-15］，機(jī)械處理過程中的熱能將木聚糖分子的側(cè)鏈和主鏈降解［16］，半纖維素的降解導(dǎo)致纖維素-半纖維素-木質(zhì)素網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的剛性下降，它們之間的連接被破壞，纖維素的結(jié)晶度降低，并和半纖維素從木質(zhì)素的網(wǎng)絡(luò)中釋放出來，從而導(dǎo)致粗纖維含量降低。Max60的粗纖維含量明顯高于Min60，纖維類物質(zhì)不容易被機(jī)械破碎，粒徑較大，篩分過程將粒徑大的啤酒糟截留，而纖維素、半纖維素和木質(zhì)素都集中在粒徑較大的啤酒糟中，該篩分技術(shù)可以初步實(shí)現(xiàn)纖維素、半纖維素和木質(zhì)素的富集分離。

圖2 不同預(yù)處理方式對啤酒糟樣品中粗纖維含量變化的影響Fig.2 Effect of different pretreatment on the crude fiber content of BSG

2.3 機(jī)械預(yù)處理對啤酒糟還原糖、水溶性總糖含量變化的影響

機(jī)械預(yù)處理對啤酒糟還原糖和可溶性糖的影響如圖3 所示。從圖3 中可以看出，經(jīng)過球磨處理的啤酒糟可溶性總糖含量提高到39.78 mg/g，比原樣的17.57 mg/g 提高了2.2 倍。而經(jīng)過刀片粉碎的啤酒糟總糖含量提高到30.27 mg/g，比原樣提高了1.7倍。植物中的纖維素是一種結(jié)晶并不是很緊密的無定型結(jié)構(gòu)，纖維素之間互相“捆綁”在一起，這樣的纖維素大多是獨(dú)立的，并通過微弱的氫鍵連接。在機(jī)械處理過程中，纖維素之間的氫鍵被打破，增加了纖維素從樣品中的溶出。而半纖維素是連接纖維素和木質(zhì)素的橋梁，同時(shí)也是熱敏感的，在機(jī)械預(yù)處理過程中，剪切力和熱能破壞了半纖維素的分子結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致纖維素、半纖維素和木質(zhì)素之間的交聯(lián)發(fā)生分離，纖維素和半纖維素從木質(zhì)素框架中釋放出來，增加了可溶性總糖的含量。另外，機(jī)械預(yù)處理過程中產(chǎn)生的剪切力和熱能，將長鏈大分子的纖維素和半纖維素切割，降低了它們的聚合度，進(jìn)而增加了可溶性總糖含量。

圖3 不同預(yù)處理方式對啤酒糟樣品中的還原糖、總糖含量變化的影響Fig.3 Effect of different pretreatment on the reducing sugar content and the total soluble sugar content of BSG

球磨處理的啤酒糟還原糖比原樣提高了約40%，而刀片粉碎的還原糖提高了18.9%，說明啤酒糟經(jīng)過機(jī)械預(yù)處理能夠?qū)⒐任锛?xì)胞在一定程度上破碎，釋放細(xì)胞中的還原糖，包裹或吸附在木質(zhì)素框架中的還原糖也被釋放出來，增加還原糖的釋放。另外，機(jī)械預(yù)處理的剪切力也可能破壞纖維素和木聚糖的分子結(jié)構(gòu)，將多糖分子撕扯成一個(gè)個(gè)的單糖或寡聚糖，進(jìn)而增加還原糖的含量。Min60組分還原糖的增加量和球磨處理樣品相當(dāng)，通過常規(guī)的刀片粉碎和組分分級技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)類似球磨處理的效果。

2.4 機(jī)械預(yù)處理對啤酒糟粗蛋白和多肽含量變化的影響

不同預(yù)處理啤酒糟樣品中的粗蛋白含量和多肽含量變化如圖4 所示。

圖4 不同預(yù)處理方式對啤酒糟樣品中的粗蛋白和多肽含量的影響Fig.4 Effect of different pretreatment on the content of crude protein and polypeptides of BSG

從圖4 中可以看到原樣、刀片粉碎和球磨處理之后的樣品粗蛋白含量基本相同，Min60組分粗蛋白含量比未處理的啤酒糟提高了24.56%。與粗蛋白含量變化相似，原樣、刀片粉碎和球磨處理的啤酒糟多肽含量基本相同，而Min60組分多肽含量最高。可見，纖維類物質(zhì)-蛋白在一定程度上實(shí)現(xiàn)了分離，蛋白含量高的部分富集于顆粒小的部分，而纖維類物質(zhì)則富集于顆粒較大的部分。

2.5 機(jī)械預(yù)處理對纖維素酶和木聚糖酶酶解效果的影響

經(jīng)過纖維素酶和木聚糖酶酶解后的可溶性總糖和還原糖含量變化如圖5 和圖6 所示，機(jī)械預(yù)處理后再進(jìn)行酶解對可溶性總糖和還原糖的釋放有著顯著的影響，啤酒糟原樣經(jīng)纖維素酶和木聚糖酶酶解，可溶性總糖含量分別為41.1 mg/g 和45.9 mg/g，還原糖含量分別為30.16 mg/g 和28.7 mg/g。而球磨過后的啤酒糟經(jīng)纖維素酶和木聚糖酶酶解，可溶性總糖含量分別為104 mg/g 和80.4 mg/g，還原糖含量分別為67.28 mg/g 和43.52 mg/g。可溶性總糖含量比啤酒糟原樣經(jīng)酶解后分別提高了2.5 倍和1.75 倍。還原糖含量比啤酒糟原樣經(jīng)酶解后分別提高了2.2 倍和1.5 倍。在復(fù)雜的飽含木質(zhì)素的纖維框架中，各聚合物的交聯(lián)和取代阻礙了酶和底物的接觸。此外，在木質(zhì)素存在時(shí)，纖維素酶通過非特異性結(jié)合到聚合物上，酶活力受到抑制，對啤酒糟酶水解有負(fù)面影響［17-18］。機(jī)械預(yù)處理降低了粒徑大小和纖維素之間的結(jié)晶度，粒徑的減小使酶作用的有效表面積增大并且降低聚合度，纖維素酶與木質(zhì)素的非特異性結(jié)合減少，酶活力有一定程度的增加，這些因素加在一起使酶解效率提高。在分級組分中，Max60組分增加的可溶性總糖和還原糖含量并沒有提高，主要是木質(zhì)纖維類物質(zhì)，刀片粉碎的剪切力不足以將這些木質(zhì)纖維類物質(zhì)降解，酶很難和底物作用導(dǎo)致還原糖釋放量沒有顯著提高。

2.6 中性蛋白酶水解對水溶性蛋白濃度變化及多肽含量變化的影響

經(jīng)過中性蛋白酶水解之后的水溶性蛋白濃度變化如圖7 和圖8 所示。由圖7 和圖8 可知，機(jī)械預(yù)處理后再進(jìn)行酶解對水溶性蛋白有著顯著的影響，啤酒糟原樣經(jīng)中性蛋白酶水解，水溶性蛋白濃度為15.7%，多肽含量為1.6 mg/g。刀片粉碎后啤酒糟和球磨后啤酒糟經(jīng)中性蛋白酶水解，水溶性蛋白濃度分別為21.6%和28.4%，多肽含量分別為1.9 mg/g和3.7 mg/g。刀片粉碎后啤酒糟和球磨后啤酒糟水溶性蛋白含量比啤酒糟原樣經(jīng)中性蛋白酶酶解分別提高了1.3 倍和1.8 倍，多肽含量比啤酒糟原樣經(jīng)中性蛋白酶酶解分別提高了1.2 倍和2.2 倍。機(jī)械預(yù)處理可以將啤酒糟的細(xì)胞結(jié)構(gòu)在一定程度上打開，使其中的蛋白類物質(zhì)更好的釋放并被酶所降解，進(jìn)而提高蛋白的消化、吸收率。

圖5 不同預(yù)處理方式對啤酒糟樣品纖維素酶、木聚糖酶酶解還原糖釋放的影響Fig.5 Effect of different pretreatment on the release of the reducing sugar by cellulase and xylanase of BSG

圖6 不同預(yù)處理方式對啤酒糟樣品纖維素酶、木聚糖酶酶解可溶性總糖釋放的影響Fig.6 Effect of different pretreatment on the release of the total soluble sugar by cellulase and xylanase of BSG

3 結(jié)論

機(jī)械預(yù)處理可以明顯的改變啤酒糟的粒徑大小，使啤酒糟的顆粒直徑變小，經(jīng)球磨處理和刀片粉碎后的啤酒糟可溶性總糖含量分別提高了2.2 倍和1.7倍，還原糖的含量分別提高了40%和18.9%。球磨處理和刀片粉碎后的啤酒糟經(jīng)纖維素酶、中性蛋白酶分別酶解后，可溶性總糖含量比啤酒糟原樣經(jīng)酶解后分別提高了2.5 倍和1.7 倍，還原糖含量比啤酒糟原樣經(jīng)酶解后分別提高了2.2 倍和1.4 倍，水溶性蛋白含量比啤酒糟原樣經(jīng)酶解后分別提高了1.8 倍和1.4 倍，多肽含量比啤酒糟原樣經(jīng)酶解后分別提高了2.2 倍和1.2 倍。經(jīng)球磨后的啤酒糟酶解效率高于經(jīng)刀片粉碎的啤酒糟。啤酒糟原樣經(jīng)過刀片粉碎，過篩通過60 目的部分(Min60)，其粗纖維含量降低為7.96%，粗蛋白含量提高了24.56%，多肽含量提高了13.04%。初步實(shí)現(xiàn)了纖維-蛋白的富集分離。

圖7 不同預(yù)處理方式對啤酒糟樣品中性蛋白酶酶解水溶性蛋白濃度的影響Fig.7 Effect of different pretreatment on the soluble protein content by neutral protease of BSG

圖8 不同預(yù)處理方式對啤酒糟樣品中性蛋白酶酶解多肽含量的影響Fig.8 Effect of different pretreatment on the polypeptides content by neutral protease of BSG

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