不同凍存液凍存慢病毒轉染后穩轉肝癌細胞株HepG2的效果比較＊

李 佳，陸會平，馮振博，莫偉嘉

（廣西醫科大學第一附屬醫院病理科，南寧 530021）

在細胞培養過程中，經常需要凍存一部分細胞，避免培養細胞表型的改變而導致重復實驗條件不一的狀況，并為進一步的實驗保存狀態良好的細胞。細胞一般采用液氮低溫保存，凍存及復蘇時必須遵循“慢凍快融”的原則。本課題組在凍存慢病毒轉染肝癌細胞株HepG2細胞時，嘗試了多種不同配方的細胞凍存液，最后篩選出一種理想的可用于液氮保存慢病毒轉染后HepG2細胞的凍存液。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器 細胞株HepG2細胞及其慢病毒轉染后穩轉細胞株為本實驗室保存。完全DMEM培養基由南京凱基生物科技發展有限公司提供，胎牛血清（FBS）由杭州四季青提供，胰酶由碧云天生物技術研究所提供，甘油和二甲基亞砜（DMSO）由北京索萊寶科技有限公司提供。－20℃冰箱由海爾電器公司提供，－80℃超低溫冰箱由日本三洋公司提供，普通高速離心機由德國Eppendorf公司提供，酶標儀 Model－450由美國Bio－Rad公司提供，液氮罐為本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 凍存方法 常規胰酶消化細胞，用完全培養基終止消化，輕輕吹打細胞成單細胞懸液，1000r／min離心1min后棄去上清液，分組加入以下凍存液：分別采用甘油和DMSO為保護劑，按以下配方各配備4種比例凍存液。（1）A液，DMEM∶FBS∶保護劑＝7∶2∶1；（2）B液，DMEM∶FBS∶保護劑＝6∶3∶1；（3）C液，DMEM∶FBS∶保護劑＝5∶4∶1；（4）D液，DMEM∶FBS∶保護劑＝0∶9∶1。然后輕輕混勻，凍存前統一調整細胞密度到1×106個／毫升，將細胞懸液移至凍存管，每管1.5mL，梯度降溫凍存，將凍存管置于4℃冰箱30min，－20℃60～120min后轉移至－80℃過夜（16h），轉至液氮保存。

1.2.2 細胞的復蘇 從液氮中取出凍存管，迅速置于40℃水浴箱中快速搖動，使其迅速融化后，將細胞懸液加入已放置4 mL含10%FBS的完全DMEM培養基的培養瓶中，輕輕混勻后置于37℃，5%CO2培養箱培養。

1.2.3 倒置相差顯微鏡下觀察 復蘇細胞6～8h后換液，在倒置相差顯微鏡下觀察復蘇后細胞的存活情況，按已貼壁細胞即為存活細胞，未貼壁細胞為死亡細胞的原則，觀察復蘇后細胞的存活率。

1.2.4 MTT法 將各組細胞接種于96孔板，2×103個／孔，每組細胞均做5個復孔，分別于種板后24、48、72、96h加入20μL MTT溶液，繼續培養4h后，小心吸盡培養液，每孔加入150μL DMSO，振蕩10min后上酶標儀檢測490nm處吸光度值，繪制生長曲線。

1.3 統計學處理 采用SPSS13.0統計軟件進行統計學分析，計量資料用表示，組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用t檢驗，檢驗水準α＝0.05，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 倒置相差顯微鏡下觀察的細胞存活率 采用甘油作為凍存保護劑時，轉染的細胞存活，且凍存液比例為0∶9∶1（DMEM∶FBS∶甘油）時，細胞存活率明顯高于其他3組，差異有統計學意義（F＝14.811，P＝0.001）；未轉染細胞的存活率均達到60%及以上，不同比例的凍存液組間差異無統計學意義（F＝1.473，P＝0.293）。采用DMSO作為凍存保護劑時，轉染組細胞存活率為0%，未轉染細胞的存活率均達到60%及以上，不同比例的凍存液組間差異無統計學意義（F＝0.890，P＝0.487）。見表1。

表1 倒置相差顯微鏡下觀察的細胞復蘇后的存活率

2.2 MTT法檢測凍存細胞復蘇后的生長情況 兩組細胞在不同比例凍存液凍存復蘇后的生長情況見圖1。圖中結果顯示轉染后細胞以甘油作為凍存保護劑細胞存活（圖1A），且凍存液中血清含量越高，復蘇后細胞的增殖能力越強（P＜0.05）；而用DMSO作為凍存保護劑凍存的轉染細胞復蘇后成活率幾近于0%（圖1B）。無論是以DMSO還是以甘油作為凍存保護劑，HepG2細胞復蘇后都能存活，且復蘇后均具有較好的增殖能力（圖1C，圖1D）。

圖1 各組細胞復蘇后生長曲線圖

3 討 論

目前認為細胞處在對數生長期時最適合凍存，而細胞凍存需要遵循“慢凍”的原則［1］。除此之外，凍存液的成分及其比例對細胞凍存、復蘇效果也起著很重要的作用，其中凍存保護劑和血清是在細胞凍存過程中最為重要的兩個因素。

Wastts等［2］認為凍存細胞時一定要加入保護劑。如果直接凍存，細胞內形成的冰晶會導致胞內蛋白質、酶變性，溶酶體膜損傷，細胞核內DNA受損［3］，從而引起細胞死亡。因此，減少細胞內冰晶的形成是減少細胞損傷的關鍵［4］。凍存保護劑除了可以減少降溫過程中胞內外冰晶的形成，還可降低“溶質效應”。目前最常用的凍存保護劑有DMSO、甘油、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）等。其中，DMSO相對分子質量小、滲透性強，通過降低凍存液冰點和細胞內外的電解質濃度，改變細胞膜的通透性，保護細胞免受冷凍損傷［5－6］。Chesne等［7］報道，DMSO與甘油等凍存保護劑相比較，具有更好的保護作用。但DMSO具有一定的細胞毒性［8］，高濃度不利于細胞的冷凍保護。Diener等［9］認為10%DMSO 為最佳凍存劑濃度［9］。然而，于麗敏［10］報道，對耐藥的腫瘤細胞株進行凍存時，使用10%～15%的甘油（占凍存液百分比）作為保護劑，細胞存活率明顯高于用DMSO作為保護劑的，此結果與本實驗結果相同。是否在腫瘤細胞受到外界損傷后（藥物刺激、慢病毒感染等），細胞對DMSO敏感性提高，無法抵御其細胞毒性，進而影響復蘇效果，這其中的機制仍有待研究。

FBS中含有豐富的細胞生長所必需的營養物質，是細胞培養中最天然的培養基［11］。若含DMSO的凍存液中血清濃度低則細胞復蘇后活力低，原因可能是FBS可以中和DMSO的毒性，以及血清中的纖維粘連素有助于細胞貼壁［12－13］。本實驗結果也表明血清濃度對復蘇后細胞的活力有一定的影響，凍存液中血清含量越高，復蘇后細胞的增殖能力越強。

總而言之，細胞凍存對實驗的順利進展至關重要。由本實驗結果可知，凍存慢病毒轉染后穩轉肝癌細胞株HepG2的最佳凍存液為90%FBS＋10%甘油。望本研究結果能給其他課題組的細胞凍存提供一種借鑒的方法。

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