代謝組學應用于中藥制劑各關鍵環節的研究概況及思考

盧君蓉，何瑤，傅超美，胡慧玲，王戰國，劉芳

中藥制劑具有悠久的歷史，在中醫藥防病治病方面發揮了積極的作用，其起源可追溯至夏禹時代（公元前2140年），那時已有藥酒，商湯時期（公元前1776年），總結寫成《湯液經》，是我國最早的方劑與制劑技術專著，并且湯劑至今仍應用于臨床[1]。近現代以來，隨著科學技術的進步和檢測手段的更新，中藥制劑的劑型更加豐富，質量控制標準也不斷提高。如2010年版《中國藥典》收載燈盞花素注射液、復方丹參滴丸等新劑型及新的給藥途徑，在制劑質量控制方面，廣泛應用了高效液相色譜法（占全部制劑品種的90.2%）[2]，并首次引入指紋圖譜技術到制劑質量控制中，更好地體現了中藥的整體性[3]。但是，目前中藥制劑的質量控制主要體現在對其中的一個或幾個成分，中藥制劑的特征指紋圖譜主要反映制劑中具有共性的化學信息，對于差異性成分的體現不足。

代謝組學屬于系統生物學的范疇，能夠及時、靈敏地對所有代謝產物進行定性和定量分析，具有整體性、動態性和綜合分析的特點[4,5]，不僅能反映中藥制劑中的共有信息，還能夠推斷差異存在的原因，與中醫藥防病治病的整體觀念不謀而合。本文總結了代謝組學在中藥制劑各關鍵環節的已有研究基礎，結合課題組的前期研究，提出將代謝組學應用于中藥制劑研究和中藥制劑質量全方位控制的研究思路，以期為創新中藥開發和完善中藥制劑的質量標準提供一定的參考。

1 代謝組學應用于中醫藥研究的概況

代謝組學是繼基因組學和蛋白質組學之后發展起來的一種研究生物系統的組學方法，主要包括metabonomics和metabolomics兩個方面，在研究植物生理代謝網絡時主要使用metabolomics的概念[6]，植物代謝組學主要研究外界因素變化對植物所造成的影響，是物種表型分析最強有力的工具之一[7]。而在藥物研發和疾病研究等領域，以動物體液或組織樣品為研究對象的，則用metabonomics較多，動物代謝組學所關注生物體系受環境刺激或基因修飾所產生的所有代謝產物的變化，并通過分析體液代謝物組成來確定生物體系的系統生化譜和功能調控規律[8]。其主要的研究平臺有核磁共振技術（NMR）、液相色譜-質譜技術（LC-MS）、氣相色譜-質譜技術（GCMS）等[9]。

由于代謝組學具有高通量、整體分析等特點，故將代謝組學技術和理念應用于中藥制劑的研究中，能更有利于盡快闡明中藥“多組分”對復雜生物系統“多靶點、整體調節”作用的科學內涵[10]。已應用于中醫證候[11]、針灸[12,13]、中藥及中藥制劑防病治病的配伍規律、物質基礎、作用機理、安全性評價等領域[14～21]。

2 代謝組學在中藥制劑各關鍵環節中的應用

運用代謝組學的方法與理念，結合多元數據統計軟件，我們課題組及其他藥學工作者對中藥制劑各關鍵環節開展了相關探索與研究，取得了較好的成績。

2.1 代謝組學在中藥制劑的投料環節的應用

投料是中藥制劑生產的關鍵環節之一，2010年版《中國藥典》規定中藥制劑處方中的藥味和臨床配方必須采用中藥飲片，中藥經過炮制可改變藥性、達到增效減毒的目的，嚴格控制原料的質量對中藥制劑生產的后續環節和成品質量意義重大。課題組采用HPLC-UV代謝組學技術對川木香煨制前后的化學成分進行對比研究，采集川木香生品和煨品的HPLC-UV色譜圖信息，通過代謝組學技術對樣品進行主成分分析（PCA）、偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）和權重矩陣的等級聚類分析（HCA），結果表明，代謝組學技術可以將川木香生品和煨品區別開，數據顯示二者的化學成分存在顯著的量變，其中有 7個成分與二者的差異性密切相關，包括主要藥效成分木香烴內酯和去氫木香內酯[22]。課題組首次以代謝組學技術，借助于LC-TOF-MS手段，對7個省區19個產地的厚樸藥材建立了代謝組學方法學評價體系，用此體系得到了13個影響不同產地厚樸質量差異的色譜峰，并借助于質譜圖初步推斷了其中10個成分；首次用代謝組學技術，對10批同一產地未“發汗”和“發汗”藥材樣品進行了評價，結果表明，代謝組學技術能將未“發汗”品和“發汗”品區別開來，影響未“發汗”品和“發汗”品藥材質量差異的主要是4個色譜峰，借助于質譜圖初步推斷了其中3個成分，分別是：阿西米洛賓、厚樸三酚B、6’-O-甲基和厚樸酚[23]。有學者[24]運用基于NMR和UPLC的植物代謝組學技術對遠志不同炮制品（生遠志、蜜遠志及甘草制遠志）進行分析，指認其中的初級代謝產物21個，次級代謝產物8個，并對三種炮制品中的遠志皂苷含量進行測定，結果從代謝組學整體角度表明，生遠志與蜜遠志、甘草制遠志的化學成分差異明顯，說明炮制可改變藥性，導致功效上的差異。通過對中藥材（生品、炮制品）的代謝組學研究，可以更好的保證中藥制劑投料的質量，為生產質量穩定、療效可靠的中藥制劑奠定基礎。

2.2 代謝組學在中藥制劑的中間體環節的應用

采用代謝組學技術，可以從中藥制劑中間體的化學信息和藥效信息等多方面評價其質量，從而很好地控制中藥制劑中間體的質量。課題組在前期引入多成分的測定方法，建立應用小粒徑色譜柱同時、快速測定紅景天（薔薇紅景天）提取物中紅景天苷、酪醇、絡賽維的HPLC方法，更好評價不同廠家提取物質量差異的基礎上，采用代謝組學的方法，結合LC-MS對紅景天提取物的質量進行評價，共成功分離和檢測到紅景天提取物中131個峰，并采用主成分分析法（PCA）、偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）和權重矩陣的等級聚類分析法（HCA）對結果進行分析，通過代謝組學的方法分析得出結果，不同紅景天提取的質量差異主要體現在6個成分，其中絡賽維的含量對紅景天提取物的質量影響較大[25,26]。說明基于液相色譜的代謝組學在中藥提取物的質量評價方法具有很大的潛力。同時，有學者[27]采用超高效液相色譜串聯質譜( UPLC-MS /MS) 技術對正常對照組、骨質疏松模型組、骨碎補給藥組大鼠尿液代謝物譜進行分析測定，發現了肌酸酐、色氨酸、苯丙氨酸、甲酚硫酸鹽、檸檬酸、壬二酸等9 個潛在的生物標志物。與正常對照組相比，模型組大鼠尿液中肌酸酐、檸檬酸、壬二酸、馬尿酸、色氨酸以及吲哚硫酸鹽含量顯著下調；苯丙氨酸、甲酚硫酸鹽及苯乙酰甘氨酸含量顯著上調，說明骨碎補醇提物可以調節骨質疏松大鼠的體內代謝紊亂，且其作用機制可能與調節能量代謝、腸道菌代謝、氨基酸代謝以及抗氧化損傷有關。還有學者[28,29]分別對銀杏提取物、知母提取物的藥效等進行了代謝組學研究。

2.3 代謝組學在中藥制劑成品環節的應用

2.3.1 代謝組學在中藥制劑成品的化學信息評價方面的應用 課題組運用代謝組學的技術對銀杏葉片質量評價進行了研究，采用HPLC-UV 法檢測12 個廠家生產的銀杏葉片的水解或未水解樣品中的大部分化學組分，色譜數據經過對齊處理與歸一化處理后，由SIMAPCA-P+12.0 軟件進行多變量數據分析，據此評價銀杏葉片的總體質量差異。結果顯示，無論水解與否，不同廠家的樣品的綜合質量均存在顯著的差異；山奈酚與另一未知成分對樣品整體質量差異貢獻較大。結果表明，12 個廠家生產的銀杏葉片總體綜合質量差異較大，應針對性地制定更加完善的質量標準以加強其質量控制[30]。有學者[31]采用代謝組學的方法對中藥四逆湯的化學物質組進行了研究，采用 HPLC-DAD-TOF/MS 技術對四逆湯中的化學成分進行分離鑒別和結構解析，并對四逆湯給藥后大鼠血漿中的吸收成分和代謝產物進行了辨識。結合數據庫匹配技術和動態調節TOF/MS 碎片電壓的方法，在四逆湯中共鑒別了 53 種化學成分，包括24 種生物堿，12 種黃酮，13 種皂苷和 4 種姜辣素類化合物，在灌胃給予四逆湯的大鼠血漿中篩選鑒定了 33 種血清活性成分和 5 種代謝產物，本研究為四逆湯的代謝和藥效研究奠定了基礎。通過運用代謝組學技術，對中藥制劑成品中的化學信息進行綜合評價，可以更加全面的規范中藥制劑的質量，為中藥制劑的質量控制提供新的模式。

2.3.2 代謝組學用于中藥制劑物質基礎研究 中藥制劑所含成分較多，結構多樣，常常難以用一個或幾個成分表征其防病治病的真正物質基礎，故對中藥制劑的質量評價研究應強調整體性。代謝組學將高通量活性篩選技術與中藥制劑物質基礎研究相結合，能夠快速獲得中藥制劑的物質基礎[32]。有學者[33]以四物湯為例，采用體外生物活性介導的藥代動力學方法研究如何更好地控制中藥質量。主要包括以下五個步驟：（1）運用數據分析挖掘四物湯的活性成分；（2）對四物湯制劑的活性成分進行定量研究；（3）模擬體外胃腸環境，測定四物湯有效成分在體外的分布與代謝情況；（4）鑒別四物湯在體外Caco-2模型細胞中可吸收和代謝的成分；（5）測定這些成分的穩定性。結果表明，不同四物湯產品中有效成分的含量有較大的差別，在數據挖掘中得到的9個有效成分有3個可以很好的被吸收并且可保持3個月以上的穩定性?！吨袊幍洹匪幎ǖ乃奈餃|控成分芍藥苷的透過性和穩定性較差，不適合作為四物湯的主要質控成分。其研究方法可以為中藥制劑物質基礎研究提供有用的途徑。

2.3.3 代謝組學用于中藥制劑作用機制研究 代謝組學所測定的對象是內源性的物質，將其運用于中藥制劑作用機制的研究中，可以更好地獲得和評價中藥制劑進入體內后的整體內源性物質和生物標志群情況，深入挖掘作用機制。學者[34]對復方丹參片血清藥物化學及代謝組學進行了研究，利用快速液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜（RRLC-Q-TOF/MS），檢測復方丹參片的入血成分和代謝產物，建立并比較給藥前后大鼠的代謝指紋圖譜；利用超高壓液相色譜串聯四極桿飛行時間質譜（UPLC-QTOF/MS），鑒定心肌缺血的生物標志物，建立并比較造模前后大鼠的代謝指紋圖譜；并進一步研究和比較五種常見西藥與復方丹參片及其有效成分對心肌缺血大鼠的保護作用，通過中西藥對比的方式，初步闡釋了復方丹參片及其有效成分（丹參酮ⅡA、丹參酚酸 B）治療心肌缺血的作用機制。還有學者[35,36]分別做了四物湯對環磷酰胺所致血虛證治療后的代謝組學研究和四物湯對輻射致血虛證小鼠作用的代謝組學研究，從不同的角度對四物湯的作用機制進行了探討。

2.3.4 代謝組學用于中藥制劑安全性評價研究 運用代謝組學的方法可以分析中藥制劑尤其是含有毒成分的中藥制劑進入體內后的內源性代謝物的變化，研究不同代謝路徑的化合物以表征服藥對機體的改變和損傷，從而評價中藥制劑的安全性。目前，代謝組學的方法已經運用到對單味中藥的安全性評價中，如學者[37]對廣防己、粉防己的肝腎毒性及代謝組學進行了比較研究，采用NMR技術測定分析給藥后血、尿中的各項指標。結果顯示，廣防己、粉防己組大鼠尿液中主要變化代謝物有檸檬酸，2-酮戊二酸、牛磺酸、馬尿酸鹽、TMAO、肌酐；血液中主要變化代謝物有不飽和脂肪酸、3-羥基丁酸、丙酮、乙酰乙酸、肌酐、NAC、OAC。結果說明廣防己、粉防己均可引起肝、腎損害，且隨給藥時間延長損傷加重；粉防己的肝、腎毒性較廣防己重。還有學者[38]運用代謝組學的方法對附子的炮制品黑順片的毒性進行了研究，采用NMR技術分析和測定大鼠灌胃給予黑順片煎液后的尿液和血漿中的?；撬帷㈢晁岷婉R尿等成分，結果表明，黑順片對大鼠的心臟毒性具有劑量依賴性。據筆者不完全統計，在2010年版《中國藥典》內共收錄了含有草烏、川烏、附子及其炮制品、馬錢子等有毒中藥的制劑品種約達60種之高[39]，若將這種研究思路和方法可以借鑒到中藥制劑的安全性評價中，如采用代謝組學的方法對含烏頭屬類原藥材的中藥制劑人參再造丸、三七傷藥片、三七血傷寧膠囊等質量進行深度評價，可以更好地保證中藥制劑的安全可靠。

3 問題與思考

3.1 本文所述將代謝組學的方法應用于中藥制劑各關鍵環節的研究綜合了植物代謝組學[40]和動物代謝組學兩個方面，主要從整體的角度對中藥制劑研究的原藥材投料、中間體、成品的各個環關鍵環節進行高通量、無偏差的全面分析，與中醫藥防病治病的整體觀相吻合，能夠更加全面地評價中藥的整體質量，在中藥研究方面具有強大的生命力。但是由于外源性成分容易干擾，檢測所需的儀器設備價格昂貴、對操作人員的專業性要求高，并且代謝組學分析數據量巨大，挖掘其中的關鍵信息并進行降維處理仍是代謝組學研究的一個技術瓶頸。國內外對于代謝組學的研究多停留在模式判別與生物標記物的鑒定層次，對于其生物學意義挖掘不夠，故建議應進一步完善代謝組學的評價方法與理論體系，重視與經典研究方法以及新的評價方法如生物活性評價、藥效學等方法和結果的銜接和結合，同時還應注重中醫藥理論的指導[41～44]，逐漸完善中藥制劑的質量評價體系。

3.2 課題組在前期研究中，運用代謝組學技術對原藥材川木香、厚樸，紅景天提取物以及銀杏葉片制劑進行研究，并取得一定的成績。但是所研究的原藥材、提取物和成品間相對獨立，研究成果相對分散，未能充分體現代謝組學在中藥制劑研究中的真正優勢。課題組在今后研究中，將在已有的基礎上，充分挖掘組方配伍和經典方劑信息，深入具體制劑品種進行系統研究，構建基于代謝組學的中藥制劑研究新模式。

3.3 中藥具有多成分、多層次的復雜特性，研究中藥制劑必須注重整體觀念。代謝組學所具備的全面評價內源性代謝物等特點決定其在中藥現代化研究方面具有很大的潛力[45]?；谖覀冋n題組在前期研究中對中藥制劑原藥材、中間體、成品的研究以及相關藥學工作者的研究成果，我們認為采用代謝組學技術，研究并評價中藥制劑研究過程中“原藥材”——“中間體”——“成品”等各關鍵環節的思路和方法，可以有利于從系統生物學和整體觀的角度開展中藥制劑研究，完善中藥制劑的質量標準體系，全面的提高中藥制劑的質量。希望可以為中藥制劑的研究提供新的思路，為中藥制劑突破現有瓶頸提供參考。

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