淺析淋巴細胞亞群功能檢測技術

鄭金波

琿春礦業（集團）有限責任公司總醫院，吉林琿春 133300

單獨測定淋巴細胞或其亞群的數量，常常不能反映淋巴細胞的功能。淋巴細胞功能試驗則是檢查淋巴細胞（或某種亞群）在特異抗原刺激作用下分泌某種細胞因子或抗體（I g）的能力。檢測方法有以下幾種。

1 酶聯免疫斑點（Euspot）法

用針對細胞因子如IFN、TNF、白細胞介素或免疫球蛋白的單克隆抗體包被Millipore Multiscreen 96孔濾膜板，加入待測PBMC（或純化的淋巴細胞亞群）及待研究的特異性抗原多肽共同溫育，當PBMC（或純化的淋巴細胞亞群）中有能特異識別抗原多肽的細胞時，這些細胞即可分泌某種細胞因子或某類I g。包被在膜上的單抗可捕獲相應的細胞因子或I g。最后再加入酶標記的抗相應細胞因子或I g的抗體反應，洗板后加入酶底物／色原呈色。以測定淋巴細胞分泌IFN-Y為例，簡述如下。

①抗人IFN-Y單克隆抗體（1 mg／mL）5 μL加10 mL pH7.4的無菌0.01 mol／LPBS，包被Millipore Multiscreen 96孔濾膜板，每100 μL，4℃過夜，用含熱滅活1%胎牛血清的PBS洗板，每孔加洗液200 μL，加入孔中吹吸后吸出，洗板6次。

②分別于每孔中加入含10%胎牛血清的RPMIl640培養液30 μL，待研究的抗原肽10 μL和待測細胞100μL[（1～3）×106／mL。同時設陰性對照（含10%胎牛血清的RPMIl640培養液）和陽性對照（加10 μL濃度為10 μL／mi的植物血凝素），于37℃ 5%CO2溫箱過夜。用PBS洗板6次。

③取出生物素化的抗人IFN-Y抗體加入10 μL無菌PBS中，振蕩混勻，每孔加入該溶液100 μL。于室溫（18～25℃）溫育1 h。用PBS洗板6次，拍干。

④取5 μL酶（ALP）標記的鏈霉親合素，加入10 mL無菌PBS中振蕩混勻，每孔加入該溶液100 μL。于室溫溫育1 h。用PBS洗板6次，拍干。

⑤取10 μL Tris緩沖液（pH 9.5），依序分別加上述NBT和BCIP顯色試劑儲存液各L00 μL，振蕩混勻即為酶底物應用液。取該溶液加入96孔濾膜板中，l00 μL／孔。置室溫溫育15～20 min，至出現黑色斑點棄去板中液體。

⑥每孔加入0.05%Tween20的PBS200 μL。置室溫10 min，終止顯色反應。棄去孔中液體，用流水沖洗3次，室溫晾干后，用ELlspot讀板儀讀取數據。

根據斑點形成的多少和大小判定淋巴細胞分泌細胞因子（如IFN-Y）或I g的功能。每一個著色斑點代表一個獨立細胞分泌細胞因子（如IFN-Y）的情況，斑點的數目代表抗原特異性淋巴細胞的數量，斑點的大小和染色程度則反映淋巴細胞分泌細胞因子或I g的水平。

2 T淋巴細胞功能測定技術

2.1 T淋巴細胞轉化試驗

在體外培養的條件下，人類T細胞通過特定抗原（結核菌素）或非特定的有絲分裂原，如植物血凝素（PHA）后會發生刺激淋巴細胞增殖和成。3 h -胸腺嘧啶的參與可能發生淋巴細胞轉化試驗測定。細胞免疫功能低下者,T淋巴細胞轉化率降低。刀豆蛋白A（ConA）是小鼠T細胞的馬仁特異性有絲分裂原。

2.2 混合淋巴細胞培養

器官移植前應先受體和供體淋巴細胞混合淋巴細胞培養實驗來選擇一個合適的捐贈者。方法和單向法雙向混合淋巴細胞培養點。雙向法兩個人一起混合淋巴細胞培養,如果不同HLA分子，兩個來源的淋巴細胞刺激將被改造。根據程度的轉換來確定兩個人不同程度的淋巴細胞HLA分子。同卵雙胞胎之間的混合淋巴細胞培養后不發生轉換。單向法將單個淋巴細胞治療與絲裂霉素或輻射失去自己的能力，但一直有著這樣的抗原性，淋巴細胞淋巴細胞混合培養，未經處理的另一個個體。根據程度的淋巴細胞轉化治療來確定兩個人淋巴細胞HLA分子不同的程度。混合淋巴細胞培養實驗中，T淋巴細胞和B淋巴細胞轉化均可發生。

2.3 延遲超敏反應皮膚試驗

已知數量的抗原（如結核菌純蛋白衍生物）注入到前臂皮膚，24～48 h后測定硬化＞硬結尺寸，直徑10 mm，被認為是陽性的。皮膚測試負可能有細胞免疫功能低下，不能接觸與相應的抗原。

2.4 細胞介導的細胞毒性試驗

用效應性CTI和51cr標記的靶細胞相互作用。被殺死靶細胞可以釋放51cr、確定目標細胞的放射性釋放51cr、可以確定效應細胞的細胞毒作用的影響的CTL。使用類似的方法還可以確定細胞毒性NK細胞活性。

3 B淋巴細胞功能檢測

①B淋巴細胞轉化試驗的淋巴細胞和不溶性金黃色葡萄球菌（B淋巴細胞分裂原），連同3 h -胸腺嘧啶參與實驗可以測定B淋巴細胞轉換發生。細菌脂多糖在小鼠B細咆分裂原。

②測定抗體生成細胞常用的溶血空斑試驗。在這個實驗中，抗體生成細胞分泌I g與綿羊紅細胞（生成）表面的抗原，補充溶血性反應參與。方法是吸附有已知的抗原生成，等待檢驗的B淋巴細胞，補充和瓊主旨糖的混合物，傾注平皿和1～3 h后，驅散肉眼可見的溶血牙菌斑和每個空點中央含有抗體形成細胞的數量、斑塊是抗體形成細胞數。是NK細胞功能的檢測。

目前國內外多采用檢測NK細胞活性來研究不同疾病狀態下NK細胞的殺傷功能。體外NK細胞活性測定的方法較多，常用的有流式細胞術、形態學方法、放射性同位素釋放法、酶釋放法、特異性熒光染料釋放法等。本節僅介紹流式細胞儀測定NK細胞功能。

NK細胞活性是一種細胞介導的細胞毒作用，它無須特異性抗體參與，也無MHC限制性，不經抗原活化即能直接殺傷靶細胞。實驗選用K562細胞為測定人NK細胞活性的靶細胞，利用碘化丙啶染料排斥法，這種染料具有只滲透到死亡細胞內的特點，用流式細胞儀檢測靶細胞受NK細胞作用后的死亡率來反映NK細胞的活性。

①肝素抗凝血2 mL，如等量生理鹽水稀釋后，用淋巴細胞分離液按常規法分離出淋巴細胞。

②用0.01 mol／LpH7.4PBS洗滌分離的淋巴細胞2次，每次1000 r／min，離心5 min。計數細胞數，作為效應細胞。

③取培養于含10%小牛血清的RPMll640培養液中處于指數生長期的K562靶細胞，用上述培養液洗滌2次、計數、備用。

④按效應細胞（淋巴細胞）：靶細胞為20：1的比例取細胞混勻于200 μL 10%小牛血清的RPMI l640培養液中。另設單純K562細胞自然死亡對照組，低速離心000r／min，1 min后，置37℃溫箱，作用2 h，置4℃冰箱，加入碘化丙碇（pI，501μg／mL）1 mL到上述試管中，1～2 h上流式細胞測定NK細胞活性。

⑤流式細胞儀測定：按儀器操作說明書進行，以PI染每。的K562細胞為死細胞，NK細胞活性則以靶細胞死亡率為指標。

檢測T、B和NK細胞主要是用免疫學技術測定它們的表面標志物，如T細胞主要測定細胞膜上的分化抗原群（cluster of differentiation，CD）CD3、CD4、CD8。其中，CD3是所有T細胞的特有標志，CD4是輔助性T細胞（TH）的標志，CD8是細胞毒性T細胞（Tc）的標志。B細胞的表面標志主要是膜免疫球蛋白或表面免疫球蛋白IgM、IgD以及CD抗原CDl9、CD20、CD22。NK細胞特異表面標志主要為CD56和CDl6。

[1] 黃曉群.聯合檢測外周血T淋巴細胞亞群及血清CEA在大腸癌患者中的表達意義[J].檢驗醫學與臨床，2009，6（12）：996.

[2] 王立芳，許惠玉，張威.免疫熒光技術和免疫酶標法在T淋巴細胞亞群檢測中的應用體會[J].齊齊哈爾醫學院學報，2004，25（3）：292.