淺談菌種的退化及有效包藏方法

姚衛紅 張麗娜 劉美秀

四川省雅安市食品藥品檢驗所，四川雅安 625000

1 菌種退化的主要表現

某一菌種如果在整體性能方面變得惡劣，并且這種變異并非由外界因素引起并遺傳給下一代，則成為菌種退化。菌種退化的具體表現一般有以下幾點：菌絲變得稀少，子實體原基的產量降低；菌種產生無性孢子的能力大幅度改變。菌種色香產生異變：色素量大幅度增加或減少，甚至由產出色素變為不產出色素，或者出現色素異常現象。代謝產物的變化：菌絲變稀，菌球變少，毛刺少，易老化，空泡增加，培養周期變長。

2 菌種退化的原因

2.1 病毒感染

在菌株的長期使用中，菌絲體或者組織體感染了病毒，在菌種細胞與染色體內同步復制，病毒顆粒因此形成一種感染潛伏，或稱平衡狀態。一旦變化的條件打破了這種平衡，則會引起菌絲生長速度減緩，菌絲細弱，氣生菌絲產量降低，不能夠徹底分解養料而出現木屑原色等現象。

2.2 營養不良

現在斜面試管PDA培養基是微生物的萬能培養基，其培養方法大同小異，多用木屑添加米糠或者麥麩等等。但是，如果長期使用基本相同的培養基，對于菌株來說往往滿足不了其營養上的生理要求，長此以往必定造成菌種的營養不良。或者因為菌種培育時間的不恰當導致培養基內養分耗盡，因此菌絲生長的活力大打折扣，導致菌種的退化。

2.3 無限傳代

母種生產中，分離出來的菌種直接應用于生產，有的對擴大母種無限制地傳代、無限制地轉管，轉管越多，創傷越多，頻繁無性繁殖一般都是負變異占絕對優勢[1]。這種無限傳代方面的變異積累到一定程度就會影響到菌絲的質量和產量，并且能夠遺傳給后代菌種。

2.4 菌種保藏不當

菌種的保藏是保證菌種質量、減緩菌種退化的重要方法，因而菌種的保藏不當很容易造成菌株的退化。目前保存菌種的方式很多，但都存在著導致菌種退化的潛在可能性。通常基因型改變在微生物中的突變率為10-5-10-7。基因突變的幾率雖然很大，但是也有可能是因為菌種保藏不當而造成的退化。

3 菌種的有效保藏

3.1 研究菌種退化與保藏的意義

隨著菌種保藏時間的延長或者菌種的多次轉接傳代，菌種本身的細胞特質有可能產生變化，或者延續優良的基因性狀，或者產生變異，菌株的退化對于菌種的生產和發展十分不利，因此，研究菌種退化與保藏的意義就在于延續菌種的優良性狀，保障菌種的質量和產量，提高經濟效益。

3.2 菌種保藏的目的和原理

菌種保藏的目的在于確保菌種的質量，保證其不被污染，不產生變異，不死亡，以便達到使用、研究和交換等諸多方面的需求。菌種保藏的基本原則首先在于對菌種質量的篩選，務必選擇質量優良的純種典型菌種進行保藏。其次，創造適合的保藏條件，以干燥、缺氧和低溫為原則，確保微生物長期處于生長繁殖受到抑制的休眠狀態，保證其不變質的前提下令其保持代謝不活潑的情況。

3.3 菌種的有效保藏方法

3.3.1 低溫保存法 ①簡單保存。首先制作孢子培養物，將菌絲懸浮液提煉出來，并用大米、小麥、麥麩等谷物原料制成營養基，并以瓊脂斜面密封。將孢子培養物放置在4℃的冰箱內保存，時間約為1～2個月。或者使谷物原料配置的孢子培養瓶處于真空狀態，并且在棉塞上浸蠟，以將外界的水汽和空氣隔絕出去，則保藏時間可以達到3～4個月。②超低溫保存。大多數微生物如多種細菌、放線菌、酵母和原蟲、病毒、噬菌體等都可以選取液氮超低溫保存的方式進行保藏，因為此類微生物不適用于簡單的冷凍干燥法。具體方法是將長期穩定的細胞懸浮液在10%的甘油或者其他低冰點液體中，在試管內密封后迅速冷卻，將試管溫度下降至-35℃，然后保藏在-150～-196℃的液氮罐或其他超低溫環境中[3]。

3.3.2 脫水保存法 ①冷凍干燥法。冷凍干燥法可將孢子懸浮液與保護劑混合，一般可選取血清或脫脂牛奶進行混合，放置于-20～-30℃的乙醇液體中速凍。然后將安培管內的空氣在低溫下抽干，并用干冰或五氧化二磷凍結水汽，將安培管熔封，低溫保存時間可達5～10年。②石蠟油封存法。石蠟封存法的保存期為一年以上，但是不能用于以石蠟油作為碳源的微生物，具體方法是將殺菌后的石蠟油倒在斜面菌種培養物上，高出斜面1厘米左右，放置在4℃冰箱內或低溫干燥處保藏。③沙土保藏法。沙土保藏法適用于放線菌、霉菌以及能產生孢子的細菌，保藏時間可達到5～7年。將沙與土以3：2的比例混合，用稀硫酸洗凈過篩處理，裝入試管內，高度為1 cm左右。進行2～3次滅菌，烘干，之后選取生長茁壯的孢子，用2～2.5 mL無菌蒸餾水制作成懸浮液，吸取適量孢子懸浮液滴入沙土試管，并進行真空抽干，使其外觀呈現松散狀態，放置于4℃冰箱內保存。

[1] 李紅，肖千明，劉娜，等.食用菌菌種退化原因分析及復壯方法的探討[J].遼寧農業科學，2010（5）：57-59.

[2] 夏鳳娜，胡惠萍，邵滿超，等.蛹蟲草菌種五種保藏條件的保藏效果對比試驗[J].食用菌，2010，32（5）：33-34.

[3] 宋越冬.蛹蟲草魯山株C0511菌絲液體培養條件[J].食用菌學報，2010，17（1）：52-54.