Toll樣受體4與2型糖尿病及其心血管并發癥

曹柳 劉寬芝

Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)是模式識別受體之一，可特異地識別病原體相關分子模式，激活細胞信號轉導途徑，從而導致一系列的炎癥和免疫反應的發生。TLR4在2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)及其心血管并發癥的發生、發展過程中具有重要作用，本文就其近年來的研究進展作一綜述。

1 TLR4簡介

1.1 TLR4的結構、分布及配體 TLR4是 Medzhitov等［1］于1997年首次發現的人類第一種Toll樣受體蛋白，屬于I型跨膜受體，由胞外區、跨膜區和胞內區組成。其胞外區由24個串聯的富含亮氨酸的重復序列組成，主要作用是識別配體;其胞內區有一段序列保守區，與白細胞介素1受體1(inter leuldn-1 receptor 1，IL-1R1)的胞內區相似，被稱為TIR區(TLR/IL-R1 homologous region)，負責活化信號的轉導。

TLR4廣泛分布于免疫細胞和非免疫細胞中，如內皮細胞、單核巨噬細胞、心肌細胞、肥大細胞、腸上皮細胞等。研究發現胰島內分泌細胞中也有TLR4分布［2］。

TLR4的配體包括外源性和內源性配體兩種。其主要的外源性配體為病原微生物表達的自身特定分子結構，即病原體相關分子模式，如脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)、肽聚糖、非甲基化的胞嘧啶、磷酸鳥嘌呤基序、活結核桿菌的某些成分等。內源性熱休克蛋白60是第一個被報道的內源性TLR4配體［3］。隨著研究的深入，表面活性劑A、透明質烷低聚糖、硫酸肝素片段、纖維蛋白原肽、β防御素2、纖連蛋白的額外域等內源性配體也相繼被報道［4］。這些內源性配體大部分是機體受損處或處于應激狀態的細胞產生的。

1.2 TLR4信號轉導通路 TLR4對某些配體的識別需要CD14和髓樣分化蛋白2(myeloid differentiatial protein 2，MD2)的協同作用，CD14必需通過TLR4才能激活細胞內的信號級聯反應，MD2可提高TLR4對LPS的敏感性，且可增加TLR4受體的穩定性。TLR4的信號轉導途徑可大體分為髓樣分化蛋白88(myeloid differentiatial protein 88，MyD88)依賴性和MyD88非依賴性途徑，前者主要通過一系列反應引起核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)易位進入細胞核內，從而誘導炎性細胞因子的產生;而后者主要負責LPS誘導的干擾素誘導性蛋白10、糖皮質激素終止反應基因16、干擾素調節基因1的表達和樹突狀細胞的成熟。

2 TLR4與T2DM

Bagarolli等［5］研究表明 TLR4 基因 Asp299Gly、Thr399Ile多態性，可降低TLR4對LPS的反應，從而防止T2DM的發生。而胡文超等［6］對天津地區365例T2DM患者及95例健康人的研究卻表明，TLR4基因Asp299Gly、Thr399Ile多態性與T2DM無明顯相關性。上述研究的不同結果可能與種族的差異和遺傳背景的不同有關。C3H/HeJ小鼠(TLR4基因功能喪失的小鼠)Ikappa B激酶復合物和c-Jun氨基末端激酶活性較對照組下降，且胰島素抵抗亦明顯減輕［7］，說明TLR4信號轉導通路可能參與胰島素抵抗(insulin resistance，IR)的發生，而IR又是T2DM的重要發病機制之一。Kim等［8］發現用棕櫚酸孵育的人微血管內皮細胞，NF-κB抑制蛋白激酶β活化，從而抑制了胰島素的信號傳遞，降低了胰島素的敏感性，這說明TLR4-NF-κB信號轉導途徑可通過影響胰島素信號通路而引起IR，參與T2DM的發生。

T2DM患者單核細胞TLR4 mRNA較對照組顯著增多［9］，表明T2DM中TLR4信號轉導通路作用增強。T2DM患者存在體重增加、IR、血糖升高、氧化應激增強等，這些可使TLR4內源性配體熱休克蛋白60、游離脂肪酸、內毒素、透明質酸、纖維蛋白原等增多，從而激活TLR4信號通路。T2DM患者細胞本身的功能異常也可使TLR4信號通路的作用增強。在單核細胞，升高的游離脂肪酸可通過釋放過量的超氧陰離子、增強NF-κB的活性和誘導促炎因子的釋放而使高糖誘導的TLR4表達增加［10］。

3 TLR4與T2DM心血管并發癥

3.1 動脈粥樣硬化 T2DM心血管并發癥的主要病理表現為動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)，TLR4介導的炎癥和免疫反應在AS的形成、進展以及斑塊破裂等各個環節均發揮重要作用。Hodgkinson等［11］建立小鼠和人的糖尿病模型，發現在TLR4功能喪失的小鼠巨噬細胞和人冠狀動脈內皮細胞，糖化低密度脂蛋白刺激合成的炎性細胞因子顯著下降，從而AS的發生率也下降，提示TLR4介導的炎性反應與糖尿病AS的發生有關。研究顯示內皮細胞中的氧化型低密度脂蛋白能被TLR4識別，從而引起白細胞介素8的分泌［12］，提示氧化應激可通過TLR4致內皮功能紊亂，進而促進AS的形成。Grenier等［13］發現LPS可通過激活TLR4介導的炎性反應，使基質金屬蛋白酶9、蛋白水解酶表達，從而降解細胞外基質，使AS的斑塊脆性增加而易于破裂，提示TLR4介導的炎性反應與AS斑塊的不穩定密切相關。

3.2 高血壓 Eissler等［14］發現與對照組比較，自發性高血壓大鼠TLR4、腫瘤壞死因子α、白細胞介素6的表達均明顯增強，通過硝基精氨酸甲酯誘發的高血壓大鼠TLR4的表達和活性亦明顯增強，提示TLR4介導的炎性反應參與高血壓的發生。Heo等［15］研究發現LPS可激活TLR4介導的信號轉導通路，使人體主動脈平滑肌細胞中的一氧化氮、白細胞介素8、血管內皮生長因子、血管細胞黏附分子l、細胞間黏附分子1水平升高，從而導致血管內皮功能紊亂，促進高血壓的發生。此外，T2DM患者體內TLR4信號轉導通路介導的IR在高血壓的發生中也起著重要的作用。IR引起的高胰島素血癥能使腎臟鈉排泄下降，從而導致水鈉潴留;能使交感神經系統和腎素-血管緊張素-醛固酮系統活性亢進，還能通過胰島素樣生長因子使動脈平滑肌細胞增生，從而導致動脈內膜增厚、管腔狹窄、阻力增加，進而發生高血壓。

3.3 心肌梗死(myocardial infarction，MI) MI的發生與炎性反應密切相關。在急性MI患者的和單核細胞，TLR4的表達水平均顯著升高［16］。Ishikawa等［17］研究表明與對照組比較，急性MI患者單核細胞TLR4的表達不僅在全身血液循環中明顯增加，而且在AS斑塊破裂處亦明顯增加。Timmers等［18］研究發現TLR4缺陷的急性MI小鼠，與正常的急性MI小鼠比較，在梗死區域中膠原密度增加伴隨的巨噬細胞浸潤較少，炎性調節細胞因子的表達較少，基質金屬蛋白酶2和9的活性也減弱;在非梗死區域，間質纖維化和心肌肥厚亦減弱。上述研究均提示TLR4介導的炎性反應可能是急性MI的發病機制之一。TLR4基因的多態性可能對MI的易感性有影響。近來研究發現，TLR4的等位基因299G可使他汀類藥物對MI的治療作用降低，使吸煙男性患MI的危險性增加［19］。

3.4 心力衰竭 心力衰竭的發病機制非常復雜，其中包括炎性反應。在心力衰竭患者中，TLR4及其下游的白細胞介素1受體相關激酶和 NF-κB信號通路分子均表達增加［20］，提示TLR4介導的炎性反應參與心力衰竭的發生。Satoh等［21］研究發現與急性MI后無心力衰竭者相比，急性MI后心力衰竭者TLR4和血漿炎性細胞因子，如白細胞介素6、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、腫瘤壞死因子α等水平均明顯升高，表明從MI到心力衰竭的演變中TLR4信號轉導通路發揮著重要的作用。致命的炭疽毒素可通過自噬誘導心臟收縮功能障礙，而Kandadi等［22］研究發現使用小干擾RNA而不是自噬抑制劑敲除TLR4后，可明顯減弱甚至消除炭疽毒素誘導的自噬，這說明TLR4介導的炎性反應在炭疽毒素誘導的心臟收縮功能障礙中起著關鍵的作用。

4 干預TLR4信號通路

4.1 改善生活方式 改善生活方式首先是戒煙。吸煙可導致TLR4介導的炎性反應的激活，又是T2DM的危險因素之一，且與糖尿病心血管事件的發生密切相關。其次是控制飲食，防止肥胖。高脂高碳水化合物飲食可導致血中脂多糖濃聚物增加，進而激活TLR4信號轉導通路，導致IR;相反，富含纖維和水果的飲食則不會引起這樣的變化［23］。第三，加強運動。體育鍛煉和高強度的體力活動可通過影響TLR4信號轉導通路而發揮抗炎作用。Oliveira等［24］研究表明體育鍛煉可降低肥胖大鼠血清LPS水平，進而抑制其肝臟、肌肉、脂肪組織中的TLR4信號通路，提高其組織對胰島素的敏感性。

4.2 糾正代謝紊亂 高脂高碳水化合物飲食可使LPS、TLR4、腫瘤壞死因子α、白細胞介素1β表達增加，引起氧化應激和炎性反應［25］，提示高脂高糖可激活TLR4信號轉導通路。Reyna等［26］研究發現棕櫚酸可使T2DM患者體內TLR4、白細胞介素6、超氧化物歧化酶2表達增加，從而激活IκB/NF-κB信號途徑，這說明游離脂肪酸可作為配體激活TLR4信號轉導通路。因此，降糖、調脂可通過抑制TLR4、降低炎性反應防止T2DM及其心血管并發癥的發生、發展。

4.3 抗炎藥物的應用 他汀類藥物可降低T2DM患者心血管事件的發生率，除調脂、抗血栓外，可能還與其抗炎作用有關。Satoh等［27］用let-7i轉染的人THP-1細胞試驗表明，阿托伐他汀可通過let-7i的表達下調冠狀動脈疾病患者的TLR4信號，從而發揮抗炎作用。桂皮醛可通過抑制TLR-NF-κB信號轉導通路而減少血漿TLR4、一氧化氮、NF-κB等的表達，從而對病毒性心肌炎起治療作用［28］。Zhang等［29］研究發現 TLR4小干擾RNA可明顯降低糖尿病小鼠TLR4 mRNA的表達水平，抑制活性氧的產生和NADPH氧化酶的活化，從而抑制心肌細胞凋亡的級聯反應，表明通過TLR4基因沉默可預防高血糖癥誘導的心肌細胞凋亡。Du等［30］研究發現煙曲霉文C可通過抑制巨噬細胞TLR4及NF-κB信號轉導通路而發揮抗炎作用，其有望成為AS抗炎治療的一個新藥。

TLR4基因在炎癥和免疫反應中起著要作用，其在T2DM及其心血管并發癥中的作用也越來越引起人們的重視。對TLR4信號轉導通路中某些環節的干預也正成為研究熱點，但大多還處在實驗探索階段。相信隨著對TLR4研究的進一步深入，會為T2DM及其心血管并發癥的防治帶來新思路。

1 Medzhitov R，Janeway CAJ，Preston-Hurburt P.A human homologue of the Drosophila Toll protein signals activation of adaptive immunity.Nature，1997，388：394-397.

2 Vives-Pi M，Somoza N，Fernandez-Alvarez J，etal.Evidence of expression of endotoxin receptors CD14，toll-like receptors TLR4 and TLR2 and associated molecule MD-2 and of sensitivity to endotoxin(LPS)in islet beta cells.Clin Exp Immunol，2003，133：208-218.

3 Ohashi K，Burkart V，Flohe S，etal.Cutting edge：heat shock protein 60 is a putative endogenous ligand of the toll-like receptor-4 complex.JImmunol，2000，164：558-561.

4 Sabroe I，Read RC，Whyte MK，etal.Toll-like receptors in health and disease：complex questions remain.JImmunol，2003，171：1630-1635.

5 Bagarolli RA，Saad MJ，Saad ST.Toll-like receptor 4 and inducible nitric oxide synthase gene polymorphisms are associated with type 2 diabetes.J Diabetes Complications，2010，24：192-198.

6 胡文超，劉德敏，孫穎，等.PPARγ、TLR4基因多態性與2型糖尿病的相關性研究.天津醫藥，2008，36：167-169.

7 Tsukumo DM，Carvalho-Filho MA，Carvalheira JB，etal.Loss-of-function mutation in Toll-like receptor 4 prevents diet-induced obesity and insulin resistance.Diabetes，2007，56：1986-1998.

8 Kim F，Pham M，Luttrell I，etal.Toll-like receptor 4 mediates vascular inflammation and insulin resistance in diet-induced obesity.Circ Res，2007，100：1589-1596.

9 Dasu MR，Devaraj S，Park S，etal.Increased toll-like receptor(TLR)activation and TLR ligands in recently diagnosed type 2 diabetic subjects.Diabetes Care，2010，33：861-868.

10 Dasu MR，Jialal I.Freefatty acids in the presence of high glucoseamplify monocyte inflammation via Toll-like receptors.Am JPhysiol Endocrinol Metab，2011，300：E145-E154.

11 Hodgkinson CP，Laxton RC，Patel K，etal.Advanced glycation endproduct of low density lipoprotein activates the toll-like 4 receptor pathway implications for diabetic atherosclerosis.Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28：2275-2281.

12 Walton KA，Hsieh X，Gharavi N，etal.Receptors involved in the oxidized 1-palmitoy 1-2-arachidonoy1-sn-glycero-3-phosphorylcholine-mediated synthesis of interleukin-8.A role for Toll-like receptor 4 and a glycosylphosphatidylinositol-anchored protein.J Biol Chem，2003，278：29661-29666.

13 Grenier D，Grignon L.Response of human macrophage-like cells to stimulation by Fusobacterium nucleatum ssp.nucleatum lipopolysaccharide.Oral Microbiol Immunol，2006，21：190-196.

14 Eissler R，Schmaderer C，Rusai K，etal.Hypertension augments cardiac Toll-like receptor 4 expression and activity.Hypertens Res，2011，34：551-558.

15 Heo SK，Yun HJ，Noh EK，etal.LPSinduces inflammatory responses in human aortic vascular smooth muscle cells via Toll-like receptor 4 expression and nitric oxide production.Immunol Lett，2008，120：57-64.

16 Kashiwagi M，Imanishi T，Ozaki Y，etal.Differential expression of Tolllike receptor 4 and human monocyte subsets in acute myocardial infarction.Atherosclerosis，2012，221：249-253.

17 Ishikawa Y，Satoh M，Itoh T，etal.Local expression of Toll-like receptor 4 at the site of ruptured plaques in patients with acute myocardial infarction.Clin Sci(Lond)，2008，115：133-140.

18 Timmers L，Sluijter JP.Toll-like receptor 4 mediates maladaptive left ventricular remodeling and impairs cardiac function after myocardial infarction.Circ Res，2008，102：257-264.

19 Balistreri CR，Candore G，Colonna-Romano G，etal.Role of Toll-like receptor 4 in acute myocardial infarction and longevity.JAm Med Assoc，2004，292：2339-2340.

20 Tillmanns J，Carlsen H，Blomhoff R，etal.Caught in the act：in vivo molecular imaging of the transcription factor NF-Kappa B after myocardial infarction.Biochem Biophys Res Commun，2006，342：773-774.

21 Satoh M，Shimoda Y，Maesawa C，etal.Activated toll-like receptor 4 in monocytes is associated with heart failure after acute myocardial infarction.Int J Cardiol，2006，109：226-234.

22 Kandadi MR，Frankel AE，Ren J.Toll-like receptor 4 knockout protects against anthrax lethal toxin-induced cardiac contractile dysfunction：role of autophagy.Br J Pharmacol，2012，167：612-626.

23 Ghanim H，Abuaysheh S，Sia CL，etal.Increase in plasma endotoxin concentrations and the expression of Toll-like receptors and suppressor of cytokine signaling-3 in mononuclear cells after a high-fat，high-carbohydrate meal：implications for insulin resistance.Diabetes Care，2009，32：2281-2287.

24 Oliveira AG，Carvalho BM，Tobar N，etal.Physical exercise reduces circulating lipopolysac-charide and TLR4 activation and improves insulin signaling in tissues of DIO rats.Diabetes，2011，60：784-796.

25 Deopurkar R，Ghanim H，Friedman J，etal.Differential effects of cream glucose and orange juice on inflammation，endotoxin，and the expression of Toll-like receptor-4 and suppressor of cytokine signaling-3.Diabetes Care，2010，33：991-997.

26 Reyna SM，Ghosh S，Tantiwong P，etal.Elevated toll-like receptor 4 expression and signaling in muscle from insulin-resistant subjects.Diabetes，2008，57：2595-2602.

27 Satoh M，Tabuchi T，Minami Y，etal.Expression of let-7i is associated with Toll-like receptor 4 signal in coronary artery disease：effect of statins on let-7i and Toll-like receptor 4 signal.Immunobiology，2012，217：533-539.

28 Ding Y，Qiu L，Zhao G，etal.Influence of cinnamaldehyde on viral myocarditis in mice.Am JMed Sci，2010，340：114-120.

29 Zhang Y，Peng T，Zhu H，etal.Prevention of hyperglycemia-induced myocardial apoptosis by gene silencing of Toll-like receptor-4.J Transl Med，2010，8：133.

30 Du RH，Li EG，Cao Y，etal.Fumigaclavine C inhibits tumor necrosis factorαproduction via suppression of toll-like receptor 4 and nuclear factorκB activation in macrophages.Life Sci，2011，89：235-240.