高效液相色譜法檢測速溶咖啡中的丙烯酰胺

呂昱 嚴敏 劉禮祥 （貴州民族大學）

一、引言

隨著國家不斷的發展，人民生活水平不斷的提高，咖啡這種“洋貨”早已滲入了普通百姓的日常生活，他口味與真實咖啡味接近且沖泡方法簡單，因此速溶咖啡銷售量遠比傳統咖啡大，但多數人并不知道的是，速溶咖啡中有一種潛在殺手“丙烯酰胺”。2005年，中華人民共和國衛生部發布公告：丙烯酰胺是致癌物質，由中國疾病預防控制中心營養與食品安全研究所提供的資料顯示，速溶咖啡含丙烯酰胺。丙烯酰胺是一種用途廣泛的重要有機化工原料，是一種中等毒性的親神經毒物，可通過未破損的皮膚、粘膜、肺和消化道進入人體，分布于人體液中，丙烯酰胺的神經毒性已經為許多學者所公認，孫鳳祥等人[8]的研究表明，丙烯酰胺急性中毒后，可使神經細胞產生炎性水腫，最終導致細胞死亡。因此嘗試建立高效液相色譜法檢測速溶咖啡中的丙烯酰胺，為將來檢測速溶咖啡中丙烯酰胺的含量提供重要的參數，對人類健康具有重要的意義。目前食品中丙烯酰胺的測定方法主要以儀器分析為主，一般的化學分析不能達到食品分析的要求。經過一定的萃取、凈化處理后，采用氣相色譜（GC）、高效液相色譜（HPLC)、質譜（MS）及三者聯用進行定性定量檢測是當前通用的檢測手段，GC-MS聯用和HPLC-MS聯用技術大大提高了測定的靈敏度和準確度，但對儀器設備的要求較高[9]，且GC-MS法需要進行衍生化，實驗步驟繁瑣且可能因不定因素導致衍生化失敗。LC/MS/MS雖然具有較高的靈敏度和準確性，但儀器價格和維護成本過高，不利于推廣運用，HPLC法具有相對成本低，樣品前處理過程比較簡單，分析比較快速、靈敏，準確度比較高等特點。因此本次研究采用了高效液相色譜(HPLC)法測定結果，配合新型小顆粒ZORBAX Eclipse Plus-C18液相柱，分離效果、速度、靈敏度，準確度等比較高，基本上滿足了我國“十一五”國家重大科技專項“食品安全關鍵技術”課題有關建立食品中丙烯酰胺測定方法的要求，適用于日常檢測，可以進一步推廣[12]。

二、實驗部分

1、材料與方法

1.1 儀器和設備

美國安捷倫公司1260高效液相色譜儀配紫外檢測器，離心沉淀器，渦旋振蕩器，長沙湘儀離心機有限公司離心機，GZX-9070MBE數顯鼓風干燥箱，超純水制備儀，電子天平，Thermo移液槍。

1.2 材料與試劑

美國安捷倫公司 ZORBAX Eclipse Plus-C18(4.6×100mm,3.5μm)色譜柱；美國安捷倫公司AccuBond SPE小柱；純度≥98%丙烯酰胺標準品購自貴州迪大生物有限公司；乙腈、甲醇均為色譜純；實驗用水均為18.25MΩ.cm超純水。

1.3 樣品來源

速溶咖啡為市場上所購多個品牌樣品，所有樣品均存放于3℃冰箱內。

1.4 色譜條件

流動相為乙腈：水(v：v,4：96)；流速為 1mL/min；保留時間為1.50min；測定波長為 200nm；柱溫：28℃；進樣體積為 20μL。

1.5 樣品前處理

準確稱取1g均質化樣品，精確到0.01g，置于10mL具塞玻璃離心管中，用純水定容至刻度，加少量正己烷進行去脂處理，于漩渦振蕩器上振蕩10min，然后4000r/min離心10min，吸取下層水相3.0mL到離心管中，在0℃15000r/min高速離心15min，吸取2.0mL下層水相過柱凈化。SPE凈化：AccuBond SPE(1000mg,6mL)柱用3.5mL甲醇、3.5mL水活化，取2.0mL提取液到SPE柱，用0.5mL水沖洗，用2.0mL水洗脫，收集全部流出液，過0.45μm濾膜后儲存于3℃冰箱備用。

2、實驗結果

1.標準曲線線性

將丙烯酰胺標準品用純水配制成 0.05、0.10、0.20、0.30、0.40μg/mL的標準溶液系列，按其定好的高效液相色譜條件測定，在 0.05～0.40μg/mL 濃度范圍內呈線性關系，以濃度(μg/mL)為橫坐標，以峰面積為縱坐標繪制標準曲線，標準曲線的線性方程為Y=423.07X+1.0342，相關系數r=0.99959。

2.樣品測定

測定了5份不同的市售速溶咖啡和咖啡豆研磨成的咖啡粉，其中2號為海南春光速溶咖啡，5號為雀巢速溶咖啡，6號為咖啡豆研磨成的咖啡粉，其余為不知名品牌咖啡，每個樣品平行測定3次，有的咖啡樣品不含丙烯酰胺，有的咖啡樣品含少量丙烯酰胺，從檢驗結果來看首先咖啡豆所研磨的咖啡粉并不含丙烯酰胺，而海南春光速溶咖啡和雀巢速溶咖啡也未檢出丙烯酰胺，可見這兩種品牌速溶咖啡在加工工藝上處理到位，而其他不知名品牌咖啡則含少量丙烯酰胺。

三、討論

丙烯酰胺在水中的溶解度較大(2155g/L)，水是丙烯酰胺的理想的提取溶劑，用水提取還可以去除速溶咖啡中的大量有機物。在提取過程中為避免丙烯酰胺變性，不宜加熱 （溫度不超過40℃）和超聲提取[11]，而且加熱和超聲波震蕩可產生微小顆粒堵塞固相萃取柱(SPE)，降低凈化效率。對于富含脂肪的樣品，需要先用正己烷除去脂肪。本次研究發現，除去脂肪后的樣品或脂肪含量較少的樣品在0℃15000r/min高速離心后，少量脂肪層被固化，可以輕易被去除，簡化了提取步驟，大大提高了提取效率和消除了干擾。