糖組學在生命科學及體育科學的研究述評

閆清偉 游春花

(西藏民族學院，咸陽 712082;西安工業大學，西安 710025)

一、糖組學的研究背景

糖組(Glycome)指的是細胞中全部糖鏈及相關糖基復合物。而糖組學(Glycomics)是專門研究糖鏈表達、調控和生理學功能的一門科學，主要研究糖蛋白的空間結構，確定糖蛋白的編碼基因，分析探明相關蛋白質糖基化的內部機制［1－2］。牛津大學教授Dwek于1988年首次提出糖生物學的概念并由此產生了糖生物學是糖組學的基礎研究部分，近年來該學科在糖鏈的結構、生物合成、生理功能等方面取得了巨大進展。日本學者的研究在尋找糖鏈合成的酶基因并解析糖鏈的功能方面取得了顯著成果，美國學者在糖組相關數據庫建立方面取得了顯著成果，2004年美國和日本兩國糖生物學方面相關專家學者在美國夏威夷州共同舉辦了2004美國、日本糖組學公會，為糖組學技術的發展提供了國際性的交流平臺［3－4］。如今世界各國都為糖組學方面的研究做出了積極的貢獻，我國在該領域的研究啟動較晚，但也取得了可喜的成果，如在寡聚糖鏈的合成、蛋白質糖基化及糖苷酶、糖基復合物和疾病等方面的研究都取得了一定的進展。

二、糖組學研究的相關技術

(一)研究策略及內容

糖雖然不是基因的直接產物，但糖與基因有著密切的聯系。因為糖組學的主要研究對象聚糖主要是從糖蛋白上分離出來的，這就與蛋白質組學以及基因組學聯系起來，而糖組學對人體糖基化和糖結合蛋白研究的系統化和高通量的特性也體現了這種聯系［5－6］。糖組學的研究中更多的是對糖肽的研究而非單純的聚糖，所以從糖蛋白中分離純化糖肽是糖組學研究的首要任務。糖組學的研究策略包括:收集研究對象個體中的全部糖組;鎖定糖肽，并將糖組中的各種糖肽組分與基因組數據庫相聯系，最大限度的利用基因組的已有成果;研究糖肽的特征性質。而糖組學研究主要解決以下四方面的問題:a基因信息，即糖蛋白的編碼基因;b糖基化位點信息，即所有可能被糖基化的位點中實際被糖基化的位點所在;c結構信息，即聚糖結構;d功能信息，即糖基化的功能［7－8］。

(二)研究技術

目前用于糖組學方面研究的相關技術已有很多種，基于各種技術在糖組學研究方面的側重點不同，我們可以人為地將其分為結構糖組學相關技術、功能糖組學相關技術、以及生物信息學相關技術［9］，對糖鏈的研究中，因為糖鏈本身沒有發色基因，為能更有效地檢測糖鏈需要對其進行標記，因而又出現了糖鏈的標記技術。

1.結構糖組學相關技術。A.糖捕捉技術已被廣泛用于糖蛋白的系統分析，通過與蛋白質組數據庫的結合使用，該方法能系統地鑒定可能的糖蛋白和糖基化位點，目前已成功用于 Caenorhabditis elegans的糖組研究［10］。其基本策略包括:凝集素親和層析分離蛋白，蛋白酶的消化，凝集素親和層析分離糖肽，高效液相質譜(HPLC)純化糖肽，以及糖肽的鑒定。然而近年來的研究發現:該技術也存在著不足之處，如不能用于O－糖肽的糖基捕捉，因其不能準確識別O－糖肽的糖基化位點;另外應用凝集素收集糖肽時，糖肽的種類會受到限制。因此有人提出應用化學捕獲技術可以收集更多的糖肽，而近年來的研究使學者們普遍認為:從生物學糖捕捉法在鑒定某些低表達蛋白質方面比化學捕捉法更有意義［9，11］。B.雙消化并串聯柱法，在糖組學研究中，水解糖蛋白時較為有效的方法是雙消化并串聯柱法。該法基本策略為:首先，用用序列特異性內切蛋白酶(如胰蛋白酶)對SDS－PAGE分離后的糖蛋白進行凝膠內水解，取少量的蛋白水解物進行質譜分析，根據肽圖譜或部分序列信息進行蛋白質鑒定;其次，將剩余的蛋白水解液用非特異性蛋白酶(如蛋白酶K)處理，此步驟能將上述水解液中的大部分多肽裂解為小分子肽(少于5個氨基酸);第三，將上述水解物通過Poros R微柱，其中的非糖基化肽被吸附在柱上，而糖肽則不被吸附，用洗脫劑將非糖基化肽從柱上洗脫后進行質譜分析測序;第四，將上述未被吸附的糖肽再通過石墨粉微柱，洗去低分子量雜質后，用30%乙晴－0.2%甲酸將肽洗脫下來，通過質譜和雙質譜可以鑒定糖肽結構［12，13］。C.其他方法還有如雙相凝膠電泳結合熒光染色和質譜技術，該技術可用于糖蛋白的篩選和鑒定;毛細管電泳結合質譜技術，該技術可用于快速常規分析以及產品監控，在分子診斷方面有很好的應用前景;另外還有核磁共振技術，該技術能夠找出蛋白質糖基化的確切位點，檢測糖鏈的空間構象，但因其敏感性不高，所以該技術對樣本數量要求較高［9，14－16］。

2.功能糖組學相關技術。具有代表性的新技術是糖芯片(glycan chip，carbohydrate microchip)，也叫糖微陣列，是繼基因芯片、蛋白質芯片之后伴隨糖組學的產生而興起的一種研究糖組學的新興技術。糖芯片技術之所以受到廣大研究者的青睞是因為它具有以下幾個優點:A.大容量。可在有限的芯片表面上展示大量的糖;B.高度敏感性。每種糖的點樣遠遠少于試驗所需要的量，但敏感性大大高于傳統的分子和免疫試驗;C.長期穩定性。點在芯片上的糖一般很穩定，無需特殊處理就能長期保存，這是由糖類故有的理化特性所決定的。糖芯片根據其用途的不同可將其分為功能糖組學芯片和藥物糖組學芯片兩類，而根據展示在芯片上糖的特征可將其分為單糖芯片、寡糖芯片、多糖芯片和復合糖芯片。糖芯片在功能糖組學研究方面所發揮的作用主要體現在以下幾個方面:一是研究糖－蛋白質的相互作用;二是研究糖蛋。與其他蛋白的相互作用;三是研究糖結合分子;四是鑒定受體的糖結合位點;六是鑒定微生物和宿主細胞交叉反應性分子標記;七是鑒定腫瘤抑制劑。而糖芯片的制作辦法目前常用的有:表面吸附法、在片合成法、共價結合法、雙層交聯法。

3.生物信息學相關技術。生物信息學和生物芯片技術是生命科學研究領域中出現的新技術。生物信息學與生物芯片密切相關，生物信息學促進了生物芯片的研究與應用，而生物芯片技術則豐富了生物信息學的研究內容。生物信息學核心是基因組信息學，包括基因組信息的獲取、處理、存儲、分配和解釋。而糖組學研究的深入必定為生物信息學提供理論基礎和技術支持，但目前由于兩者都還處于研究的起步階段，一些現成的基因技術和蛋白質技術并不能很好地應用于糖組學研究，同樣糖組學的相關技術也并沒在生物信息學方面發揮理想作用，相關技術的創建與推廣如芯片技術、復雜系統分析技術、信息系統分析技術等，都有待于進一步的研究。值得一提的是目前生物信息技術中相關數據庫和網絡信息為糖組學的研究提供了有益的幫助。如利用CFG可以查找糖鏈亞結構、分子量和組成等許多參數;而CCSD收集的眾多糖鏈結構數據為糖譜的構建和糖鏈結構查新提供了很好的保障［17］。

4.糖鏈的標記技術。目前用于糖鏈標記的技術主要有放射性同位素標記、探針標記、紫外及熒光物質衍生化技術等［18－20］。

三、糖鏈的功能

糖組學研究的功能性糖鏈主要有功能性低聚糖、功能性多糖、糖簇分子。有研究報道:功能性低聚糖具有調節和恢復腸道內微生態平衡、促進礦物質的吸收和維生素的合成等一系列保健功能;功能性多糖對疾病的發生、發展和預后有著重要作用，主要表現在它的免疫調節作用、誘導腫瘤細胞凋亡、降血壓作用、抗病毒作用和抗輻射作用;而糖簇的作用則通過多分子糖鏈與凝集素結合產生的簇效應來實現，它能夠提高糖鏈的生物活性，其作用主要表現在抗病毒、免疫治療、器官移植方面，有些還具有肝靶向作用等［21－25］。糖鏈一般由相同或不同型的單糖聚合而成，攜帶有重要的生物信息，有著重要的生物學功能:如標記功能、細胞免疫功能、血型抗原、細胞惡化標記、水溶性、保護性、修飾等功能。其標記功能主要在糖鏈、糖蛋白的識別和被識別反應過程中起作用;免疫系統中起免疫作用的糖蛋白主要是靠其單糖基與受體的相互作用來激發其免疫功能;血型抗原指紅細胞膜上不同類型的寡糖鏈的糖蛋白和糖脂分子，它們與血清中相應的抗體構成識別體系;細胞惡化時細胞膜上的相應糖蛋白會發生改變，如惡性腫瘤發生時，細胞膜上的P糖蛋白過度表達，通過對相關糖蛋白的監控，可以盡早發現細胞的惡化;糖鏈的水溶性功能主要是因為糖分子本身水溶性極高，它與蛋白質或脂肪等大分子結合后，可以大大提高這些物質的親水性，從而改善其功能和理化性質，這為改進基因表達產物的功能和物理化學性質提供了新思路和新手段;糖鏈的保護作用主要體現在:糖鏈分子上的酸性糖基能夠保護蛋白的穩定性;而糖鏈的修飾作用主要體現在:糖鏈能直接參與蛋白質的空間折疊過程，這對于糖蛋白的結構、功能有重要作用［4，26－28］。

四、糖組學在基礎生物學領域的研究

糖鏈雖不是基因的直接產物，但與糖鏈合成的相關基因卻種類龐雜、數目巨大。要破譯如此龐大數量的基因，并探明其與糖鏈合成的具體信息，對于處于初級階段的糖生物學來說，無疑是件難事，所以目前生物學界把目標鎖定在其中少數直接作用于糖類的管家基因和具有突變致死性的糖類相關基因上，以及某些關鍵糖基轉移酶、糖苷酶、凝集素和糖類轉運蛋白基因及其產物上，作為化學糖生物學的主攻靶標，因為正是這些基因與人類的疾病與健康關系最為密切［29］。

管家基因(housekeeping genes)是維持細胞最基本的生存功能所必需的基因，因而也是在所有或大部分有核細胞內都能保持高水平表達的基因，亦即其表達與否與細胞分化狀態無關。與此相對應的是奢侈基因(1uxury genes)或組織特異性基因，它們是參與多細胞生物細胞社會性相互作用的基因，其表達具有細胞類型特異性。由于糖鏈普遍分布于細胞表面和細胞外基質，糖鏈在細胞分化與細胞社會性相互作用過程中具有公認的重要作用，因此大量糖類相關基因均屬于奢侈基因。然而糖鏈在細胞內部還能夠確保蛋白質的正確折疊與定向分布，參與信號轉導、調控染色質的結構和基因轉錄，這些功能對于維持細胞內大分子網絡的穩態均有關鍵作用。這類作用與糖代謝一樣，是細胞基本生存所必需的，因而都涉及管家基因的活動。

基因敲除技術的大規模應用使人們陸續發現了許多突變后具有致死性的糖類相關基因，這類基因突變常常涉及某種關鍵糖生物酶的活性降低，人們已經嘗試用小分子化合物作為“分子補丁”，與缺陷的酶特異結合并糾正其結構缺陷，從而恢復酶的催化能力。人體內多種天然關鍵碳水化合物酶的活性有很大的儲備或冗余性，即酶活性大大超過正常生理活動的需要，所以即使只能將缺陷酶的活性恢復到野生酶的10%－20%左右，也足以糾正底物或異常產物的累積，治愈疾病。但由于每一種酶、甚至同一種酶的不同基因缺陷所需要的“分子補丁”都大不相同，所以必須進行大量的篩選工作，并建立突變基因庫和“分子補丁”庫，才能擴大受益患者的范圍。

細胞對糖鏈信息的編碼主要是通過糖基轉移酶(GT)催化的糖基化(glycosylation)反應實現的。糖基化是生物體內糖鏈或糖苷生成的關鍵反應，它是指在糖基轉移酶的催化下，一個糖分子與另一個糖分子(或糖基)、或者一個糖分子與其他生物有機分子之間以生成糖苷鍵的方式共價結合的過程。糖基轉移酶的催化反應方式有兩大類型:一類為供體糖基的端基碳構型反轉;另一類為供體糖基的端基碳構型保持不變。多數糖基轉移酶以糖核苷酸為活化的糖基供體，但也有一些糖基轉移酶能夠利用除了糖核苷酸以外的其他活性糖苷前體如糖基磷酸脂作為糖基供體。糖苷酶(glycosNases)對糖鏈的修剪及其他碳水化合物酶對糖鏈的多種修飾活動也起著重要的輔助加工作用。人體中的供體活性糖苷主要有四種類型:UDP－糖核苷酸(其中的糖基包括 G1c、Gal、G1cNAc、GalNAc、GlcA、IdoA、Xyl);GDP－ 糖核苷酸(糖基包括Man和Fuc);CMP－糖核苷酸(只有CMP－Neu5Ac一種);糖基磷酸長萜醇脂(包括 Glc－P－Dol、Man－P－Dol、OS－P－Dol)。細胞對糖類信息的解讀主要通過糖鏈參與的分子相互作用而實現。糖類與蛋白質之間的相互作用涉及到種類繁多的、能夠特異地識別糖鏈的蛋白質，主要包括:酶類、抗糖抗體、轉運蛋白、細胞因子、除抗體以外的免疫分子或免疫因子、凝集素等。其中凝集素(1ectin)是能與糖類特異結合，但不具備針對糖類的酶活性、亦并非針對糖類的跨膜轉運蛋白、也不屬于抗體的蛋白質。凝集素對糖類的特異性結合是靠其分子上的糖識別結構域(CRD)實現的。此外，糖類與糖類之間的糖－糖相互作用也直接參與細胞對糖鏈信息的解讀，例如:細胞表面血型糖抗原Lex－Lex相互作用在早期胚胎細胞的相互識別中有重要意義。

五、糖組學在醫學領域的研究

近年來的研究認為:從某種意義上講，糖藥物的副作用比其它藥物小，它們靶向定位到機體的特定部位，不僅能進一步減少副作用，而且能降低使用劑量。臨床醫師運用一種測試追蹤技術，認識到糖尿病的血紅蛋白有異常糖基化現象，該現象與相關酶的活性有關。糖基化的蛋白質以外的血紅蛋白被認為與糖尿病患者的組織損傷有關。這種異常糖基化也引發其他一些疾病，如某些先天性肌肉萎縮癥、癌癥、自身免疫性關節炎、類風濕關節炎等。很多種疾病是由帶有異常糖鏈的糖蛋白和糖脂引起的。

從science雜志的一個主題為碳水化合物和糖生物學的報道中我們可知糖組在未來的醫藥領域有廣闊前景［30］。例如，glyconutrients［糖質營養素，包括8種糖:葡萄糖(Glu)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、巖藻糖(Fuc)、木糖(Xy)、N－ 乙酰葡糖胺(GlcNAc)、N－乙酰半乳糖胺(GalNAc)、N－乙酰神經氨酸－唾液酸(NANA)］對兩種不同類型的先天性異常糖基化所引起的遺傳性疾病都是有用的。這些疾病的發生一般與基因突變引起的相關酶合成有關，因為正是這些異常合成的酶引起了糖蛋白上糖鏈的異常。該先天性糖基化障礙引發了慢性胃腸道、血液、神經系統的問題，若在飲食營養中加入甘露糖則有明顯療效。巖藻糖補劑對于治療另外一種先天性糖基化異常病－－白細胞自身免疫缺陷病有重要作用。另一個例子是應用糖生物學研制疫苗。如流感嗜血桿菌B或Hib疫苗，這是一個糖基疫苗。糖作為組成部分，有助于改善疫苗的抗原。另一個潛在的應用是研發癌癥疫苗。通過改變腫瘤抗原的糖鏈結構，使免疫系統可以更好地識別、攻擊并摧毀腫瘤。新糖基運載系統等化療藥物的商業發展使得5－氟脲嘧啶被提出并進行I期和Ⅱ期的研究。

糖組學研究在病毒性心肌炎的解構方面也有進展。改建引起病毒性心肌炎病毒的被覆糖結構(例如那些造成乙型肝炎和丙型肝炎的病毒)，可能在防止病毒復制方面是有用的。糖基化的一個主要的作用，體現在T－細胞抗原結構和功能的維持，主要組織相容性復合物與免疫球蛋白的糖鏈的合成、穩定、和識別。此外，ABO血型是基于在糖鏈組成上的不同而劃分的。另一有關糖生物學的研究人員在麻省理工技術學院的研究也指出［31］:許多碳水化合物以糖鏈即聚糖形式存在，而不是單糖形式。這種糖鏈有的與蛋白結合并以聚糖蛋白的形式作為膜被覆于細胞表面，它們參與細胞的信號轉導以及細胞與周圍環境的物質、能量的交換。糖蛋白在結構上有很高的選擇性，例如，肝素結合抗Ⅲ，抑制血液凝固。此外，這種信號對多種生化途徑和疾病進程是至關重要的:如癌癥，血管生成，組織修復，骨骼發育，心血管疾病，和微生物感染。糖胺聚糖，如與肝素密切相關的硫酸乙酰肝素也與蛋白質有著密切的聯系。當結構異常時，它們可能會導致腸和膀胱保護屏障的喪失，從而引發炎癥性疾病［32］。如上所述，糖組作為基礎的藥物療法正在研究。

六、糖組學在體育科學領域的研究

糖組學作為一個新興的研究就熱點，其在體育科學中的研究尚未見報道，但依據功能糖組攜帶的強大的信息量，其在體育科學的應用前景會比較廣泛，且隨著學科間的進一步融合和新興交叉學科的出現，糖組學將會逐步被廣大體育科研工作者認識，進而在體育科研領域的應用取得突破。比如利用糖組相關技術探明運動相關的優秀糖組信息，進而建立糖組信息庫，再結合基因組、蛋白質組相關信息可使運動員選材更加科學合理;利用糖組信息探明相關管家基因的功能，可推動相關基因興奮劑檢測技術的發展;探明相關糖蛋白在免疫反應、信號轉導等的生物信息，有利于運動疲勞機制的研究，可用于運動員機能評定、延緩疲勞以及疲勞后的快速恢復;同時，糖組學的發展在運動性損傷以及運動性疾病的防治方面也會得到很好的應用，比如近年來有研究證實，糖質營養素在治療重癥肌無力方面有明顯療效。隨著運動相關糖組信息的研究，也必將引起相關專門性的新興學科的出現，比如運動功能糖組學。

［1］王川.糖組學:破解生命信息的第3種途徑［J］.生物學通報，2005，40(5):8－9.

［2］金征宇.糖組學的基礎科學問題［J］.食品與生物技術學報，2008，27(1):2－4.

［3］郭麗娜，王洪榮，李憲臻等.糖組學研究策略及前沿技術研究進展［J］.中國生物化學與分子生物學報，2006，22(9):686.

［4］盧雯靜，劉銀坤等.糖組學研究技術進展及其意義［J］.國際檢驗醫學雜志，2006，27(4):366－367.

［5］郭麗娜，王洪榮，李憲臻等.糖組學研究策略及前沿技術研究進展［J］.中國生物化學與分子生物學報，2006，22(9):687－688.

［6］孫興權，李靜，耿美玉，管華詩.糖組學研究中糖蛋白糖鏈結構分析技術［J］.化學進展，2007，19(1):132－134.

［7］金征宇，李學紅.功能性唐與糖組學［J］.食品與生物技術學報，2007，26(6):1－2.

［8］竇江麗，譚成玉，白雪芳等.寡糖對免疫系統作用的研究進展［J］.中國生化藥學雜志，2005，26(6):377－379.

［9］蔡孟琛，李中軍.糖化學［M］.北京:化學工業出版社，2006:426－431.