環(huán)丙沙星對(duì)3種作物的毒性

李通，金彩霞，朱雯斐，劉國(guó)光，劉海津，鄭立慶

河南師范大學(xué)環(huán)境學(xué)院 河南省環(huán)境污染控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室黃淮水環(huán)境與污染防治教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新鄉(xiāng)453007

隨著我國(guó)大中城市和鄉(xiāng)鎮(zhèn)集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)的 迅速發(fā)展，含有各種獸藥抗生素的畜禽糞便的年產(chǎn)出量在不斷增加。大量的畜禽糞便排放是構(gòu)成我國(guó)抗生素面源污染的主要原因之一。然而，研究表明，抗生素類藥物只有15%可被吸收利用，大約85%未被代謝而被直接排放到環(huán)境中，導(dǎo)致生態(tài)環(huán)境中檢測(cè)出的獸藥種類和濃度逐年增加［1］。2002年Campagnolo等［2］在豬和家禽大型養(yǎng)殖廠儲(chǔ)便池中檢測(cè)到多種畜用抗生素(濃度＞100μg·L-1)，并在其附近的地表水及地下水中檢測(cè)到ng·L-1水平的同類抗生素。隨著獸藥的大量使用，其在環(huán)境中的累積濃度亦在增加，Hamscher等［3］報(bào)道，在施用廄肥的土壤表層，檢測(cè)到了土霉素和金霉素的殘留，其最大濃度竟分別高達(dá)32．3和26．4 mg·kg-1。絕大多數(shù)抗生素以原藥或代謝產(chǎn)物的形式經(jīng)動(dòng)物的糞尿排出，通過(guò)一定的途徑進(jìn)入農(nóng)田，使作物的生存環(huán)境發(fā)生變化，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育造成不同的影響。僅有的研究表明，施用動(dòng)物糞肥和污泥后，作物產(chǎn)量降低。這除了與氮和重金屬的過(guò)度施用有關(guān)外，在某種情況下也與糞肥和污泥中的獸藥殘留有關(guān)［4］。植物不同組織對(duì)污染物毒性反應(yīng)不同，根系和葉是植物體內(nèi)污染物主要的蓄積場(chǎng)所，它們對(duì)污染物的反應(yīng)較明顯。對(duì)農(nóng)作物而言，獸藥殘留對(duì)植物的危害有兩種情況［5］，一是反映在農(nóng)作物減產(chǎn)或品質(zhì)降低;二是反映在可食部分有毒物質(zhì)積累量已超過(guò)允許限量，但農(nóng)作物產(chǎn)量卻沒(méi)有明顯下降或不受影響。藥物對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的影響取決于藥物的類型和劑量，藥物與土壤吸附能力及其在土壤中的穩(wěn)定性，同時(shí)藥物對(duì)作物的影響還隨藥物和植物的品種不同而不同。土霉素和氯四環(huán)素對(duì)雜色豆的生長(zhǎng)有明顯的抑制作用，具體表現(xiàn)為:植株的生節(jié)、鮮質(zhì)量下降，并影響植物對(duì)鈣、鉀和鎂等離子的吸收。土霉素和氯四環(huán)素能促進(jìn)蘿卜和小麥的生長(zhǎng)，但對(duì)玉米的生長(zhǎng)卻沒(méi)有影響［6］。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于有機(jī)農(nóng)藥和重金屬污染土壤對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育影響的報(bào)道很多，而針對(duì)獸藥在土壤中殘留及其對(duì)植物的毒性作用方面的研究卻鮮有報(bào)道，因此急需開(kāi)展相關(guān)方面的研究。

目前已建立的高等植物毒理實(shí)驗(yàn)方法主要有3種:根伸長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)、種子發(fā)芽實(shí)驗(yàn)和植物幼苗早期生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)［7-9］。雖然有關(guān)用這些方法進(jìn)行土壤污染現(xiàn)場(chǎng)修復(fù)以及土壤生物修復(fù)過(guò)程的污染診斷研究已有較多報(bào)道［10-11］，但目前針對(duì)此法探究抗生素獸藥殘留污染開(kāi)展的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)還較少，因此，有必要展開(kāi)相關(guān)方面的研究。

通過(guò)研究環(huán)丙沙星對(duì)玉米、白菜、蘿卜種子發(fā)芽、根伸長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)的影響，旨在揭示環(huán)丙沙星的毒性效應(yīng)，以及可能對(duì)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來(lái)的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法(M aterials and methods)

1．1 實(shí)驗(yàn)材料

供試藥品:環(huán)丙沙星鹽酸鹽一水合物，純度﹥98%，梯希愛(ài)(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司。

供試種子和土壤:小白菜(Brassica chinensis L．，品種為上海青)，發(fā)芽率為98%;蘿卜(Raphanus Sativus L．，盛豐二號(hào))，發(fā)芽率80%;玉米(Zeamays L．，鄭單958)，發(fā)芽率為98%。以上3種種子均購(gòu)自新鄉(xiāng)市種子公司。供試土壤采自河南師范大學(xué)校內(nèi)生物實(shí)驗(yàn)田0～20 cm表土。

1．2 實(shí)驗(yàn)方法

用甲醇配置250 mg·L-1的環(huán)丙沙星母液，然后依次根據(jù)需要配成不同濃度的環(huán)丙沙星水溶液。稱取50 g風(fēng)干土壤于90 mm直徑的玻璃培養(yǎng)皿中，分別加入不同濃度的環(huán)丙沙星水溶液5mL，攪拌均勻，并用去離子水調(diào)節(jié)土壤含水量至田間最大持水量的60%，用鑷子將玉米、蘿卜、小白菜種子均勻播種于土壤中(種子放置時(shí)，保持種子胚根末端和生長(zhǎng)方向呈直線)，蓋好玻璃培養(yǎng)皿，并置于恒溫培養(yǎng)箱中25℃下暗處培養(yǎng)。培養(yǎng)期間，通過(guò)稱量質(zhì)量用去離子水補(bǔ)充蒸發(fā)損失的水分。設(shè)不含環(huán)丙沙星為對(duì)照組，同時(shí)設(shè)1組未播種種子的空白實(shí)驗(yàn)，以此了解實(shí)驗(yàn)期間內(nèi)，環(huán)境條件對(duì)環(huán)丙沙星濃度的影響。當(dāng)對(duì)照種子的發(fā)芽率＞90%，根長(zhǎng)度為20mm時(shí)，結(jié)束實(shí)驗(yàn)。確定種子根和芽伸長(zhǎng)抑制濃度，使其抑制率在10% ～70%之間，開(kāi)始正式實(shí)驗(yàn)，抑制率(IR)按下式計(jì)算:

預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，玉米、蘿卜和小白菜的實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)天數(shù)較短，且相差不大，均為4～5 d，且提取測(cè)定了實(shí)驗(yàn)前后空白土樣中的環(huán)丙沙含量，研究發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)前后環(huán)丙沙星濃度基本未變化，這表明外界環(huán)境條件(如含水量、暴露時(shí)間等)對(duì)環(huán)丙沙星濃度的影響可以忽略不計(jì)。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，環(huán)丙沙星的處理濃度分別為:玉米為 0．5、1．0、2．0、5．0、10．0 和 20．0 mg·kg-1;蘿卜為0．5、1．0、2．0、3．0 和 5．0 mg·kg-1;小白菜為0．1、0．5、1．0、2．0 和 4．0 mg·kg-1。每個(gè)培養(yǎng)皿中放入20粒種子作1次重復(fù)，每個(gè)濃度設(shè)3次重復(fù)，同時(shí)設(shè)不含環(huán)丙沙星為空白對(duì)照組。在與預(yù)實(shí)驗(yàn)相同條件下進(jìn)行作物種子發(fā)芽和生長(zhǎng)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，測(cè)定各處理濃度下種子的根伸長(zhǎng)、芽伸長(zhǎng)，計(jì)算根長(zhǎng)度和芽長(zhǎng)度的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差，并繪制濃度-抑制率曲線，進(jìn)行回歸分析，并計(jì)算ID50(抑制率為50%時(shí)，土壤中環(huán)丙沙星的濃度，mg·kg-1)。

1．3 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel2003和Origin 7．5數(shù)據(jù)處理軟件(美國(guó)Microcal Software公司)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及回歸分析，計(jì)算出ID50，對(duì)劑量-效應(yīng)曲線進(jìn)行擬合并作圖。本實(shí)驗(yàn)差異顯著性水平為P＜0．05。

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2．1 環(huán)丙沙星污染對(duì)作物種子發(fā)芽、芽伸長(zhǎng)和根伸長(zhǎng)的影響

作物根伸長(zhǎng)、芽伸長(zhǎng)與土壤中環(huán)丙沙星濃度的關(guān)系見(jiàn)圖1和表1。由圖1和表1的R2值可知，在土壤受到環(huán)丙沙星污染時(shí)，土壤中污染物的含量與上述3種作物的根伸長(zhǎng)及芽伸長(zhǎng)抑制率顯著相關(guān)(P ＜0．01)，而3種作物(玉米、蘿卜、小白菜)的發(fā)芽抑制率與土壤中環(huán)丙沙星濃度之間不具有相關(guān)性(P ＞0．05)。

表1 環(huán)丙沙星對(duì)3種作物生長(zhǎng)抑制的回歸方程Table 1 Regression equation of CPFX for inhibitoryrate of growth of three crops

由表1的ID50值可以看出，環(huán)丙沙星對(duì)3種作物根伸長(zhǎng)的抑制作用都強(qiáng)于對(duì)芽伸長(zhǎng)的抑制，即在環(huán)丙沙星的脅迫下，上述3種作物的根伸長(zhǎng)均較芽伸長(zhǎng)敏感。

綜合以上分析可知，相比于其他2個(gè)指標(biāo)(芽伸長(zhǎng)、發(fā)芽率)，根伸長(zhǎng)對(duì)環(huán)丙沙星濃度的變化最為敏感，其對(duì)環(huán)丙沙星毒性敏感順序依次是:根伸長(zhǎng)＞芽伸長(zhǎng) ＞發(fā)芽率，這與宋玉芳等［12］和鮑艷宇等［13］研究的其他污染物對(duì)作物的生態(tài)毒性效應(yīng)是相一致的。這可能與種子發(fā)芽和根伸長(zhǎng)的生長(zhǎng)過(guò)程有關(guān)。通常情況下，植物種子發(fā)芽過(guò)程除了受外界環(huán)境條件影響外，還可從胚內(nèi)得到養(yǎng)分供應(yīng)，在較低濃度污染物的脅迫下，土壤污染對(duì)植物種子發(fā)芽的毒害作用在一定范圍內(nèi)僅表現(xiàn)為部分抑制，只有當(dāng)土壤受到嚴(yán)重污染時(shí)，種子發(fā)芽才能完全被抑制，而根從一開(kāi)始就完全暴露于土壤中，其生長(zhǎng)和發(fā)育全過(guò)程受外界條件的影響較大，因此，根對(duì)土壤污染的反應(yīng)更敏感［12］。

圖1 環(huán)丙沙星對(duì)3種作物發(fā)芽(◆)、芽伸長(zhǎng)(■)和根伸長(zhǎng)(▲)的抑制Fig．1 Effect of ciprofloxacin(CPFX)on seed germination(◆)and elongation of root(■)and shoot(▲)of three crops

另外，由圖1還可以看出，無(wú)論是玉米、蘿卜還是小白菜，其芽伸長(zhǎng)抑制率與根伸長(zhǎng)抑制率之間的差異均隨著環(huán)丙沙星濃度的增大而逐漸減小。當(dāng)土壤中環(huán)丙沙星的濃度為0．5 mg·kg-1時(shí)，玉米、蘿卜、小白菜3種作物芽伸長(zhǎng)與根伸長(zhǎng)抑制率之間差異分別是12．65%、17．75%和 13．86%。然而當(dāng)土壤中環(huán)丙沙星的濃度達(dá)到3種作物各自最高濃度(玉米為20．0 mg·kg-1，蘿卜為 5．0 mg·kg-1，小白菜為 4．0 mg·kg-1)時(shí)，環(huán)丙沙星對(duì)3種作物根伸長(zhǎng)與芽伸長(zhǎng)抑制率基本相近，差異非常不顯著，最大相差僅為5．43%。這可能是由于環(huán)丙沙星濃度較高時(shí)，土壤污染程度嚴(yán)重，土壤的滲透壓增加，致使部分環(huán)丙沙星滲透到種皮內(nèi)部，從而影響作物生長(zhǎng)，這種情況下種皮對(duì)芽的保護(hù)作用消失，從而較大程度地抑制了芽的伸長(zhǎng)。

2．2 3種作物對(duì)環(huán)丙沙星的敏感性比較

目前，經(jīng)常采用植物的ID50來(lái)評(píng)價(jià)污染物的毒性強(qiáng)弱［14］。不同植物對(duì)不同污染物的敏感性不同，以此可用于篩選針對(duì)不同污染物的敏感性指示植物及用于評(píng)價(jià)不同藥物的毒性大小，從而可為污染物的安全性評(píng)價(jià)提供依據(jù)。由表1可知，3種作物在環(huán)丙沙星的脅迫下，其敏感性順序?yàn)?小白菜＞蘿卜＞玉米。這可能與藥物的作用機(jī)制及作物的吸收機(jī)制有關(guān)。抗生素類藥物的對(duì)植物的毒性主要是植物體內(nèi)該污染物與葉酸相互競(jìng)爭(zhēng)的結(jié)果，葉酸與嘌呤合成有關(guān)，而嘌呤是細(xì)胞分裂素和脫落酸的前體，因此植物吸收藥物而降低了對(duì)葉酸的吸收從而影響了其正常的生理功能［15］。環(huán)丙沙星可能通過(guò)抑制植物體葉酸的合成，從而抑制其生長(zhǎng)，進(jìn)而對(duì)其根和芽伸長(zhǎng)產(chǎn)生了較強(qiáng)的脅迫效應(yīng)，但藥物對(duì)植物生長(zhǎng)抑制的具體作用機(jī)制有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。

綜上所述，可以得到以下結(jié)論:

(1)當(dāng)土壤受到環(huán)丙沙星污染時(shí)，土壤中環(huán)丙沙星濃度與3種作物(玉米、蘿卜和小白菜)的根伸長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)抑制率具有相關(guān)性(P ＜0．05)，但與這3種作物種子發(fā)芽抑制率之間不具有相關(guān)性(P ＞0．05)。

(2)作物的發(fā)芽率、根伸長(zhǎng)和芽伸長(zhǎng)對(duì)環(huán)丙沙星的毒性敏感順序依次為:根伸長(zhǎng)＞芽伸長(zhǎng)＞發(fā)芽率。

(3)從環(huán)丙沙星對(duì)玉米、蘿卜和小白菜根伸長(zhǎng)的ID50值判斷，3種作物在環(huán)丙沙星的脅迫下，其敏感性順序分別為:小白菜＞蘿卜＞玉米。

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