Pv MSP1－19重組蛋白體外對間日瘧患者外周血T細胞免疫功能的影響

李光友，夏 惠，陶志勇，陳 勇，方 強

2.安徽省蕪湖市第二人民醫院檢驗科，蕪湖 241001

瘧疾是嚴重危害人類健康的寄生蟲病之一。據世界衛生組織2009年全球瘧疾報告，全球有約2.5億人發病，近90萬人因瘧疾感染而死亡。由于瘧疾紅細胞內期疫苗能通過抑制裂殖子侵入紅細胞，降低瘧原蟲密度，從而能減少間日瘧的臨床發病，同時也起到間接抑制瘧疾傳播的作用［1］。瘧原蟲裂殖子表面蛋白1（Merozoite surface protein 1，MSP－1）是一種表達于裂殖子表面的蛋白，參與裂殖子對紅細胞的入侵。重組MSP1－19與自然感染間日瘧原蟲患者的血清具有很強的免疫反應性［2］。因此其作為瘧疾防治的重要疫苗候選分子引人關注。據此，本文用純化的MSP1－19重組蛋白刺激間日瘧既往感染者外周血T細胞，以分析其對T細胞的免疫功能的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗對象 安徽北部地區半年內間日瘧既往感染者11例，年齡20～70歲（平均45歲），其中男性5例，女性6例。所選間日瘧既往感染者均排除肝炎與結核病史。

1.2 主要試劑和設備 淋巴細胞分離液購自天津TBD生物技術公司，重組人白細胞介素－2（IL－2）購自長春長生基因藥業公司，新生小牛血清購自杭州四季青生物公司，RPMI 1640購自美國GIBCO公司，熒光抗體IFN－γ－FITC，IL－4－PE，CD4－PeCy5.5，CD3－APC購自美國Caltag Laboratories公司，莫能霉素（Monensin，Mo）購自美國 Sigma－Aldrich公司，CFSE購自美國Molecular Probes公司，流式細胞儀FACSCalibur購自美國BD公司，純化的PvMSP1－19重組蛋白系本室自制。

1.3 方法

1.3.1PvMSP1－19重組蛋白體外刺激間日瘧既往感染者T細胞分泌細胞因子效應的分析 取間日瘧既往感染者肝素抗凝血，按常規方法分離單個核細胞，用含10%NBS的RPMI 1640培養液調淋巴細胞濃度為1×106/m L，按每孔1 m L加入24孔培養板，分別加入純化的PvMSP1－19重組蛋白5μg和IL－2 50 U，同時設置單獨加IL－2的對照組，每3～4 d補加50 U IL－2以維持細胞生長，培養至第7 d時收獲細胞。

1.3.2 CFSE標記法分析PvMSP1－19刺激T淋巴細胞增殖效應的分析 用RPMI 1640將淋巴細胞調制成1×106/m L細胞懸液。加入CFSE至終濃度為1μmol/L，置37℃水浴箱孵育10 min后，用含10%NBS的RPMI 1640培養液洗3次。再用含10%NBS的RPMI 1640培養液調淋巴細胞濃度為1×106/m L，按每孔1 m L加入24培養板，分別加入純化的PvMSP1－19重組蛋白5μg和IL－2 50U，同時設置單加IL－2對照組，每3～4 d分孔傳代并補加IL－2 50 U以維持細胞生長，培養至第7 d收獲細胞。

1.3.3 T細胞分泌細胞因子的流式細胞儀分析收集培養第7 d的淋巴細胞，再用含10%NBS的RPMI 1640培養液調濃度為1×106/m L，在刺激組中再加入純化的PvMSP1－19重組蛋白5μg，37℃、5%CO2環境下刺激培養24 h，在培養最后4 h時加入終濃度為2.5μmol/L的Mo以阻斷細胞因子的分泌，同時設置不加PvMSP1－19重組蛋白的對照組。收集再刺激培養后的細胞，加入CD4－PeCy 5.5、CD3－APC，4℃避光反應30 min，染色緩沖液（staining buffer，SB）洗兩次，用2% 多聚甲醛（PFA）4℃固定30 min，SB洗兩次，透膜緩沖液（PBS－10%NBS－0.1%皂素 ）4℃避光透膜15 min，加入終濃度為5%的牛血清白蛋白（BSA）和10%的小鼠血清，4℃避光封閉30 min，加入IL－4 PE、IFN－γ－FITC和相對應的同型對照熒光抗體，4℃避光反應30 min，透膜緩沖液洗兩次，SB洗一次，2%PFA 200μL重懸細胞，用流式細胞儀進行檢測，每一測定管均檢測和獲取10萬個細胞。

1.4 統計學分析 數據處理采用spss16.0統計軟件，數據以均數χ2標準差表示。比較刺激組與未刺激組的差異采用雙樣本t檢驗；P＜0.05為有統計學意義。

2 結 果

2.1PvMSP1－19重組蛋白刺激間日瘧既往感染者外周血T細胞分泌細胞因子效應的分析 經PvMSP1－19重組蛋白刺激擴增后的T細胞進行流式細胞儀分析，與PvMSP1－19重組蛋白未刺激組（3.46%）比較，CD8＋T 細胞分泌IL－4的百分率在刺激組（8.04%）明顯升高（P＜0.05），而IFN－γ的分泌兩組（0.82%，1.05%）間并無差異（P＞0.05）。分泌IL－4和IFN－γ單陽性CD4＋T細胞的百分率在刺激組（1.81%，0.19%）與未刺激組（1.89%，0.05%）之間均并無明顯差異（P＞0.05）。圖1所示為某一典型個體CD8＋和CD4＋T細胞分泌IL－4和IFN－γ情況。

2.2PvMSP1－19重組蛋白刺激間日瘧既往感染者外周血細胞增殖水平的分析 用Modfit軟件分析刺激擴增后刺激組與未刺激組淋巴細胞增殖動力模型，計算各組淋巴細胞增殖指數（PI），PvMSP1－19重組蛋白刺激組CD8＋T細胞增殖指數PI（5.65%）明顯高于未刺激組（3.69%，P＜0.05），而CD4＋T細胞增殖指數PI在兩組（1.74%，1.78%）間無差異（P＞0.05）。圖2所示為某典型個體CD8＋T細胞和CD4＋T細胞增殖指數PI。

圖1 Pv MSP1－19抗原刺激間日瘧既往感染者PBMC后CD8＋和CD4＋T細胞分泌IL－4和IFN－γ的情況注：A.同型對照；B.刺激組；C.未刺激組Fig.1 The percentage of IL－4 and IFN－γCD4＋ and CD8＋ cells of PBMC stimulated with Pv MSP1－19 antigenA：Isotype control；B：Stimulated group；C：Unstimulated group

圖2 Pv MSP1－19抗原激活間日瘧既往感染者PBMC后CD4＋和CD8＋T細胞增殖情況注：A.刺激組；B.未刺激組Fig.2 Proliferation of CD4＋ and CD8＋T cells from PBMC stimulated with Pv MSP1－19 antigenA：Stimulated group；B：Unstimulated group

3 討 論

抗體和CD4＋T細胞在抗紅內期瘧原蟲感染中發揮重要的作用，而對于CD8＋T細胞的保護作用尚存在爭議［3－7］。近期眾多研究發現 CD8＋T細胞在瘧疾紅內期也可產生保護性免疫應答，并可通過釋放一些細胞因子使脾臟的巨噬細胞活化，從而有助于紅內期瘧原蟲的清除［8－10］。

免疫記憶性是機體對外界致病原最有效的抵抗機制，可保證機體再次遇到同一致病原時迅速啟動免疫防御機制，消滅病原體，是疫苗作用的物質基礎。本實驗利用PvMSP1－19重組蛋白刺激間日瘧既往感染者外周血淋巴細胞，通過流式細胞儀檢測CD4＋T細胞及CD8＋T細胞的增殖和分泌細胞因子的情況，可反映既往感染者體內可能存在的記憶性T細胞的類別和這些記憶性T細胞可能通過釋放何種細胞因子來發揮免疫防御作用。實驗結果顯示，CD8＋T細胞在PvMSP1－19重組蛋白刺激7d后發生顯著活化增殖，而CD4＋T細胞的增殖不明顯。Jangpatarapongsa等對間日瘧現癥感染者發病時、抗瘧治療后14 d、28 d及60 d時外周血兩種早期記憶性T細胞進行了動態觀察，結果也顯示，早期CD4＋記憶性T細胞隨著時間推移，呈下降趨勢，但早期CD8＋記憶性T細胞在隨訪期間保持在較穩定水平［11］。

已知CD8＋T細胞除直接殺傷靶細胞外，根據分泌細胞因子不同可分為Tc1和Tc2兩大亞群，其中Tc1細胞主要分泌IFN－γ，Tc2細胞主要分泌IL－4。本試驗表明在間日瘧既往感染者的外周血內存在一定數量針對PvMSP1－19重組蛋白的記憶性CD8＋T細胞（Tc2），這些CD8＋T細胞通過分泌IL－4發揮免疫防御作用。后者可促進B細胞的增殖、分化和特異性抗體的產生。同時IL－4可誘導嗜酸性粒細胞活化，在抗寄生蟲感染中發揮著重要作用。而記憶CD8＋T細胞的產生與維持也受到IL－4的調節，體外CD8＋T細胞與IL－4共培養后轉移至正常鼠體內可分化為長效記憶細胞［12］，IL－4還可能提供防止凋亡的信號、誘導細胞向記憶性亞類分化［13］。

綜上所述，PvMSP1－19重組蛋白在體外能刺激間日瘧既往感染者外周血CD8＋T細胞顯著增殖活化，后者通過分泌IL－4而發揮免疫調節作用，這將為PvMSP1－19疫苗的研制和開發提供一定的理論基礎。

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