肝動脈栓塞聯合射頻消融對兔肝癌模型VEGF及MVD的影響

陳長廣，倪才方，陳 瓏

目前肝動脈化療栓塞術（transcathater atery chemoemblization，TACE）聯合射頻消融（radiofrequency ablation，RFA）已成為治療不可切除肝癌的有效方法，可以提高對肝癌的治療效果[1-5]，但也存在不足之處，由于受三維空間的限制而易導致腫瘤殘留等，對大肝癌的治療常不徹底。殘余腫瘤的生物學行為變化與患者的預后有很大的關系。本實驗旨在通過檢測聯合治療后兔肝癌殘余腫瘤組織血管內皮生長因子（VEGF）和微血管密度（MVD）表達，觀察其對殘余腫瘤組織血管生成的影響，并探討其治療肝癌的機制。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗動物采用4～5月齡新西蘭大白兔（由蘇州大學醫學院實驗動物中心提供），體重2.0～2.5 kg，雌雄不限。動物VX2腫瘤細胞株為鱗狀細胞癌。

1.2 方法

1.2.1 兔VX2肝癌模型制作和分組 按參考文獻[6]報道的方法，在CT引導下采用經皮穿刺瘤塊推注法成功制作兔VX2肝癌模型。模型建好后3周行CT平掃和增強檢查，選取腫瘤直徑為2.5～2.7 cm的45只瘤兔，隨機分為對照組（假性治療組）、單純RFA組和TACE聯合RFA組（聯合治療組），每組15只。每組在治療后1、4、7 d分別各處死5只瘤兔。

1.2.2 TACE治療 荷瘤兔麻醉后，仰臥于DSA機床上，切開股動脈后引入4 F H1導管及3 F微導管，超選擇至肝固有動脈，造影可見粗大的腫瘤供血動脈及網片狀腫瘤染色（圖1）。在透視下40%碘化油0.2～0.4 ml栓塞至腫瘤染色消失。術后予以預防感染、補液。

1.2.3 RFA治療 荷瘤兔麻醉后，仰臥于自制金屬手術車上，于上腹部正中切開并充分暴露肝臟腫瘤結節，將射頻針插入腫瘤中央后消融10 min，功率25 W。對照組開腹后在直視下將射頻針插入腫瘤中心部位，不接射頻發生器，10 min后拔除射頻針，關腹；單純RFA組僅進行射頻治療。本實驗應用裸露端長為2 cm的冷循環單極射頻針進行治療（消融直徑最大為2 cm），故治療后會出現消融周邊區的腫瘤殘余。

1.2.4 聯合治療 TAE治療7 d后再行RFA治療。聯合治療后行增強CT檢查示腫瘤中心壞死無強化，腫瘤周邊可見強化的腫瘤活性組織（圖2）。

圖1 肝動脈造影示肝臟腫瘤強化明顯

圖2 聯合治療后增強CT檢查示腫瘤中心壞死無強化，腫瘤周邊可見強化的腫瘤活性組織

1.2.5 標本處置及觀察項目 每只兔在預定時間點處死后取腫瘤中心組織及消融區周邊組織行病理學觀察。切除的標本立即在4%甲醛液中固定，經沖洗、脫水、透明、切面向下包埋制成蠟塊后切片，HE染色，觀察細胞形態和凝固性壞死旁中央區的擴展情況。

1.2.6 VEGF及MVD表達檢測 采用免疫組化SP法檢測，VEGF染色陽性細胞胞質呈棕黃色為陽性。VEGF半定量判定標準參照Inan等[7]的方法，在400倍光學顯微鏡下隨機觀察5個凝固性壞死的周邊區域，按著色強弱分為4個等級，無著色0分，淡黃色1分，棕黃色2分，棕褐色3分，并計算HSCORE 得分[8][HSCORE=ΣPi（i+1）；i=0，1，2，3；Pi表示評分為i的比例]。5個視野的HSCORE積分的平均值作為該張切片的最終積分。MVD陽性結果判定按參考文獻[9]，先在40倍視野中，隨機選擇5個新生血管最密集區，即所謂“熱點”，然后在400倍光鏡視野下記錄微血管數。每只選取血管密度最大的、不同區域的5個視野圖像，取5個圖像的MVD值的平均數作為該組的MVD值。任何腫瘤細胞與鄰近微血管分界清楚并被染成棕黃色或棕褐色的內皮細胞團當成1個微血管。同1個血管的“頭”與“尾”正巧在同一切面上，也作為2個微血管計算。

1.3 統計學處理

采用SPSS13.0軟件進行統計學分析，計量資料用均數±標準差（±s）表示，統計方法采用完全隨機分組設計的方差分析和LSD-t檢驗，Pearson相關分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般情況

TACE和（或）RFA后瘤兔出現精神萎靡、納差、嗜睡等癥狀，一般3 d后恢復正常；聯合治療后上述癥狀更明顯，部分瘤兔出現拒食。有5只瘤兔在聯合治療后24 h內死亡，相關死因可能為TACE后再行RFA對瘤兔創傷過大、麻醉過量、出血等。瘤兔死亡后及時補充。

2.2 殘余腫瘤組織VEGF表達

VEGF陽性信號定位于腫瘤細胞胞質，瘤灶中陽性細胞多呈簇狀分布或大片狀分布，染色呈棕黃色，在腫瘤組織周邊及腫瘤血管周圍明顯密集。對照組腫瘤組織內VEGF陽性表達較高，呈棕黃至棕褐色（圖3）。聯合治療后毀損周邊區域內殘余腫瘤內VEGF低表達（圖4）。

2.3 殘余腫瘤組織MVD表達

所有標本中，CD31染色陽性的血管內皮細胞顯示清晰，表現為微血管多有明顯管腔，或僅有不規則管腔；陽性著色點為單個內皮細胞，或為簇狀分布的內皮。瘤灶竇樣血管CD31表達強陽性，除門管區及中央靜脈外，正常肝組織的肝竇對CD31基本不表達，殘余腫瘤的間質中表達較為密集。對照組腫瘤組織內MVD高表達，黃染區為腫瘤微血管（圖5）。聯合治療后毀損周邊區域內殘余腫瘤內MVD 低表達（圖6）。

2.4 殘余腫瘤組織VEGF及MVD的時間變化

圖3 對照組腫瘤非壞死區內VEGF表達較高（SP×400）

圖4 聯合治療后毀損周邊區域內殘余腫瘤內VEGF低表達（SP×400）

圖5 對照組MVD高表達（SP×400）

圖6 聯合治療后殘余腫瘤MVD低表達（SP × 400）

單純RFA組及聯合治療組VEGF和MVD表達均明顯低于對照組，兩治療組與對照組間兩兩比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。3個不同時間點內單純RFA組和聯合治療組VEGF和MVD表達兩兩比較差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。殘存腫瘤VEGF與MVD表達呈正相關（表2）。

表1 殘存腫瘤VEGF和MVD表達變化（±s）

表1 殘存腫瘤VEGF和MVD表達變化（±s）

組別 對照組 單純RFA組 聯合治療組 F值 P值VEGF表達1 d 2.186±0.2971.595±0.1681.651±0.19510.330.0024 d 2.304±0.3371.660±0.1841.695±0.17411.430.0027 d 2.293±0.2691.651±0.2361.725±0.12812.860.001 MVD表達1 d 24.08±4.4389.88±2.09112.800±3.22224.490.0004 d 25.60±5.54610.76±2.96112.680±2.93520.300.0007 d 25.40±5.37611.76±3.31513.480±2.617617.710.000

表2 殘存腫瘤VEGF與MVD之間相關性（±s）

表2 殘存腫瘤VEGF與MVD之間相關性（±s）

組別 動物數 VEGF MVD R值 P值對照組 52.293±0.26925.400±5.3760.9850.002單純RFA組 51.651±0.23611.760±3.3150.9410.017聯合治療組 51.726±0.12813.480±2.6180.9890.001

3 討論

TACE和RFA都是治療不可切除肝癌的有效方法，但兩者各有其不足之處。肝癌豐富的血供可帶走RFA治療時的大量熱量，使治療區域發生凝固性壞死的時間相應延長，加之在三維上仍可能出現治療漏空而致病灶凝固壞死不完全，使治療效果不佳。TACE對大肝癌有一定的治療作用，但仍為姑息性治療方法，對絕大多數腫瘤不能“根治”。若先栓塞肝動脈后再行射頻治療則可使肝臟血流量減少而增加RFA的毀損范圍，故RFA與TACE聯合可以取長補短，可發揮二者的優勢并有協同放大作用。國內外臨床研究表明，聯合治療組肝癌結節毀損面積較單純RFA組明顯增大，并且長期效果（復發率、生存率）優于單純 RFA 組[4，10-11]。

但由于惡性腫瘤呈浸潤性生長而難以明確其界限、微小腫瘤子灶診斷困難、腫瘤所在的解剖位置、肝腫瘤體積大、形態不規則、射頻針工作范圍不夠以及穿刺技術等因素，聯合治療后仍存在不同程度的腫瘤殘余，從而成為日后復發、轉移的根源，難以達到“完全治愈”的目的。程洪濤等[12]報道TACE聯合RFA治療原發性肝癌時，腫瘤直徑30～50 mm者完全消融率為92.6%，50～70 mm者為53.8%，而最大徑超過70 mm的患者僅為22.2%。因此，研究術后殘存腫瘤的血管狀況有著重要的意義。本實驗通過制作聯合治療后兔肝VX2殘余瘤模型，動態觀察殘余腫瘤的生物學活性變化，為臨床應用提供理論依據。

迄今多數學者充分肯定了MVD與腫瘤生長、轉移、預后間的密切關系，認為它是反映惡性腫瘤生物學行為的重要參數，VEGF可作為判斷肝癌預后的重要指標。VEGF和MVD可作為判斷原發性肝癌侵襲、轉移和預后的指標。本實驗同時檢測VEGF與MVD的表達情況，定量評價殘余腫瘤的血管生成，以觀察兩種治療方法對殘余腫瘤新生血管的影響。

本實驗結果顯示，在對照組中VEGF及CD31均高表達，MVD明顯高于瘤旁組織，提示腫瘤組織有較多的新生血管，在保證腫瘤組織充分的血液供應同時，由于新生血管的血管壁較薄，結構發育不良，也是腫瘤細胞轉移的前提。本實驗通過檢測殘留腫瘤組織VEGF、MVD的表達，結果發現單純RFA治療后殘余腫瘤組織VEGF和MVD的表達較對照組均明顯降低（P＜0.01），并且維持在相對穩定的狀態，聯合治療后殘余腫瘤組織VEGF和MVD的表達也較對照組明顯降低（P＜0.01）。盡管聯合治療組殘余腫瘤組織VEGF和MVD的表達較單純RFA組絕對值略高，但差異無統計學意義，說明盡管TACE可能會引起腫瘤組織VEGF和MVD表達增加，但RFA治療后仍能有效抑制殘余腫瘤組織VEGF和MVD的表達，RFA可以通過有效的破壞腫瘤微血管，控制腫瘤的血管形成，減少腫瘤血液供應，有效的滅活腫瘤，減少腫瘤轉移的機會。

本研究同時發現，在單純RFA組和聯合治療組中，隨著VEGF表達強度降低，腫瘤MVD均相應減少，兩者之間存在顯著正相關，表明VEGF在促進新生血管形成中起著重要作用，是促進新生血管形成的重要因子。VEGF陽性細胞分布以腫瘤壞死區域周圍、包膜下區域及新生瘤巢中較為豐富，與新生血管的分布亦存在較好的一致性。提示VEGF能刺激殘癌細胞新生血管生長，并可能在治療后殘癌組織血供重建中起重要作用。盡管聯合治療能抑制腫瘤血管生成，但殘余腫瘤VEGF和MVD仍存在一定程度的表達，聯合應用抑制血管生成的藥物可能會達到更好的治療效果。

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