32P-玻璃微球瘤內注射抗腫瘤作用及對外周血白細胞的影響

陳金鳳，王振興，曾雅靜（廣東省東莞市中心血站 523930）

上世紀80年代中期，有研究將32P做成玻璃微球用于治療腫瘤，其主要特點是可在腫瘤局部形成點狀內照射放射源，所載高能量核素不泄漏進入血液，具有瘤內血管局部栓塞致腫瘤缺血缺氧壞死的作用，應用前景十分廣闊。本研究采用小鼠腫瘤模型實驗，探討32P-玻璃微球（32P-GMS）抑制腫瘤的效果及其對外周血細胞計數的影響，間接反映該治療方法對機體免疫系統、骨髓組織的影響，從而為放射性同位素腫瘤內注射治療腫瘤提供實驗數據。

1 材料與方法

1.132P-GMS 由成都中核高通同位素股份有限公司提供。為灰褐色微球，粒徑46～76μm，密度為2.0～2.5g／cm3。32P溶出度30d之內小于0.1%。放射純β射線，放射性核純度為99%，其中γ射線含量小于2%。放射性比活度為550～3 700 MBq／g（15～100mCi／g）。32P放射性半衰期為14.28d，平均能量為0.69MeV（最大能量1.71MeV）。在實體瘤組織內的最大穿透距離為8.0mm，平均距離為3.2mm。使用前須將32PGMS與超液化碘油（約100mg／mL）充分振蕩混勻，制備成混懸液后使用。

1.2 實驗小鼠及瘤株

1.2.1 清潔級實驗小鼠 周齡6～8周，體質量（20±2）g，雌雄各半，由廣東醫學院實驗動物中心提供。

1.2.2 小鼠S180肉瘤細胞 廣東醫學院天然藥物實驗中心傳代保存并提供。

1.3 主要儀器 凈化工作臺（SW-CJ-1D型）由蘇州凈化設備廠提供，電子天平（AEG-220）由日本SHIMADZU公司提供，全自動血細胞計數儀（BC-3000PLUS）由深圳邁瑞公司提供，電熱鼓風干燥箱（CS-101-2AB）由重慶銀河試驗儀器有限公司提供。

1.4 方法

1.4.1 實驗分組 采用隨機區組法將實驗小鼠隨機分為對照組、腫瘤模型組和低、中、高3個不同劑量32P-GMS實驗組，每組8只。對照組小鼠每只在腹腔內注射0.5mL生理鹽水，腫瘤模型組小鼠每只在實體瘤中心注射0.5mL生理鹽水，低、中、高劑量32P-GMS實驗組分別在實體瘤中心注射終濃度為0.74、3.7、18.5MBq／mL的32P-GMS混懸液各0.5mL。

1.4.2 腫瘤模型的建立 將傳代保存的S180肉瘤細胞無菌接種于小鼠腹腔；7d后，選擇生長良好的小鼠，采用頸椎脫臼法處死小鼠。然后將小鼠置于75%的酒精中浸泡消毒5min，取出小鼠置操作臺上，用醫用鑷子牽拉起小鼠腹壁皮膚，用5mL醫用注射器穿刺入小鼠腹腔空腔內，緩慢采集腹水，注射器內可見乳白色濃稠腹水，然后用無菌生理鹽水按照1∶4的比例稀釋腹水，取少量稀釋后的腹水于離心管中，加入錐蟲藍染色，染色后用計數盤在顯微鏡下計數活細胞數，活細胞數大于98%方可使用。如果達到使用要求應盡快在超凈工作臺接種于實驗小鼠右腋窩皮下，接種量0.2mL／只，于30min內完成。然后每天觀察記錄小鼠的活動情況，第7天取眼球靜脈血后，脫臼處死，完整剝取腫瘤組織。

1.4.3 外周血白細胞分類計數 各實驗組小鼠第7天取眼球靜脈血，取血量0.5mL／只，用白細胞稀釋液稀釋計數，并做血涂片，瑞姬氏染色，計算淋巴細胞占白細胞的百分率。

1.4.4 腫瘤抑制率 不同劑量32P-GMS組小鼠給藥后第7天稱重，處死后完整剝離腫瘤組織并稱瘤重，計算抑瘤率。抑瘤率＝（對照組瘤重-不同劑量32P-GMS組瘤重）／對照組瘤重×100%。

1.5 統計學處理 采用SAS8.0統計學軟件，計量資料采用方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 小鼠活動情況 每天觀察記錄各實驗組小鼠的基本狀況，與對照組比較，腫瘤模型組及不同劑量組小鼠的活動明顯減少，行動遲緩，精神差，被毛疏松，無光澤，呼吸困難，飲食飲水減少。腫瘤內注射32P-GMS后的各組小鼠體質量增加相對緩慢，飲食飲水略有增加，整體情況略有好轉。

2.2 抑瘤作用32P-GMS能明顯抑制小鼠S180肉瘤的生長，高劑量實驗組抑瘤率達32.4%，不同劑量32P-GMS實驗組與腫瘤模型組比較差異有統計學意義（P＜0.01）。腫瘤模型組瘤塊明顯增大，界限不清，質地較軟，剝離困難，有的腫瘤浸潤至胸骨、鎖骨及腋窩后側等處。不同劑量32P-GMS實驗組瘤體相對縮小，腫瘤界限清晰，質地較硬，容易剝離，不同劑量32PGMS實驗組的平均抑瘤率分別為15.2%、20.4%、32.5%，抑瘤率與劑量呈正相關。不同劑量32P-GMS實驗組抑瘤率均高于模型組（P＜0.05或P＜0.01），結果見表1。

表1 32P-GMS對小鼠S180肉瘤的抑制作用（±s，n＝8）

表1 32P-GMS對小鼠S180肉瘤的抑制作用（±s，n＝8）

注：與模型組比較，aP＜0.05，bP＜0.01。

分組 劑量（MBq／mL）腫瘤組織重量（g）抑瘤率（%）對照組0.0 0.0 0.0模型組 0.0 1.22±0.22 0.0低劑量實驗組 0.74 1.04±0.25a 15.2±1.3a中劑量實驗組 3.7 0.99±0.11b 20.4±2.1b高劑量實驗組 18.5 0.84±0.17b 32.5±2.7b

2.3 治療前后小鼠體質量變化 體質量變化反映了小鼠整體功能狀態。由表2可以看出，32P-GMS作用后所有小鼠體質量均有不同程度的增加。對照組小鼠體質量增加明顯，模型組小鼠體質量增加緩慢，模型組及不同劑量32P-GMS實驗組小鼠體質量明顯低于對照組（P＜0.01），低、中、高劑量組小鼠體質量明顯高于模型組（P＜0.01）。

表2 32P-GMS對S180肉瘤小鼠體質量的影響（±s，n＝8）

表2 32P-GMS對S180肉瘤小鼠體質量的影響（±s，n＝8）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01。

分組 劑量（MBq／mL）體質量（g）試驗前 試驗后 增加體質量（g）對照組0.0 23.14±0.26 33.16±0.77 10.12±0.32模型組 0.0 22.99±0.43 30.60±0.17 7.67±0.24a低劑量實驗組 0.74 22.57±0.49 31.56±0.72 8.29±0.33ab中劑量實驗組 3.7 22.97±0.62 31.24±0.45 8.27±0.42ab高劑量實驗組 18.5 22.24±0.59 31.55±1.13 9.41±0.58ab

表3 32P-GMS治療對腫瘤小鼠白細胞的影響（±s，n＝8）

表3 32P-GMS治療對腫瘤小鼠白細胞的影響（±s，n＝8）

注：與對照組比較，aP＜0.01；與模型組比較，bP＜0.01。

分組 劑量（MBq／mL）白細胞（×109／L）淋巴細胞（%）對照組0.0 6.78±0.256 26.75±2.43模型組 0.0 5.82±0.161a 30.87±2.37a低劑量實驗組 0.74 7.80±0.153c 45.00±2.46ab中劑量實驗組 3.7 8.77±0.126ab 38.71±1.99b高劑量實驗組 18.5 11.65±0.520ab 18.42±1.62ab

2.432P-GMS對腫瘤小鼠外周血白細胞的影響 白細胞水平能及時地反映機體對輻射的早期應急反應。由表3可見，隨注射劑量的增加，白細胞呈明顯的上升趨勢。模型組及中、高劑量組小鼠白細胞數明顯高于對照組（P＜0.01或P＜0.05），不同劑量組小鼠白細胞數明顯高于模型組（P＜0.01或P＜0.05）；32P-GMS照射后，模型組及低、中劑量組淋巴細胞百分率明顯高于對照組，高劑量試驗組腫瘤小鼠淋巴細胞百分率明顯低于對照組和模型組（P＜0.01）；低劑量組腫瘤小鼠淋巴細胞百分率明顯高于模型組（P＜0.01）。

3 討 論

放射性核素內照射是腫瘤放射治療的一種重要途徑，尤其對手術不能切除的惡性腫瘤，放射性核素內照射治療臨床效果非常明顯，正在成為腫瘤治療的另一重要發展方向。Nakhgevany等［1］報道總結了腫瘤內照射治療藥物應具備的特點：（1）β射線，能量高，純度高，不含γ射線；（2）藥物局部點狀分布，不被正常組織吸收，放射活性局限在腫瘤局部，無其他不良反應；（3）半衰期適合，能量多能在短期內釋放，小劑量可將各類腫瘤細胞殺死，且易于輻射防護。32P-GMS具備以上特點，所以是一種理想的腫瘤內照射放射性核素材料。32P-GMS具有內照射和栓塞雙重功能，在肝癌、胰腺癌、腦膠質瘤的動物實驗和臨床應用中均有報道［2-5］，應用32P-GMS治療后，均發現其能使腫瘤體積縮小，且無其他不良反應。本次實驗結果顯示各劑量組小鼠瘤內注射32P-GMS治療7d后，瘤體明顯縮小，抑瘤率與照射劑量呈正效應機制，且腫瘤向周圍組織浸融明顯減少，說明32P-GMS有很強的抗腫瘤作用。射線抗腫瘤的機制主要包括直接導致腫瘤細胞生物大分子成分破壞；其次是產生高毒高氧化的各種自由基和過氧化物，這些物質可導致腫瘤細胞死亡［6］；第三是受照射細胞釋放的一些活性物質或信號分子誘導未受照射細胞凋亡［7］，或通過細胞間通訊連接介導這一過程［8］。國內實驗結果提示，內照射可促進或加速腫瘤細胞凋亡，且隨著劑量的增加，凋亡指數增高［9］，本次研究結果與此一致。

32P的有效射程可以達到正常組織，對正常組織能夠產生輻射效應，最為直接的是對血細胞的影響。從實驗結果來看，白細胞計數明顯上升，是急性輻射損傷的特征；淋巴細胞分類百分率也有明顯的變化，32P-GMS低劑量組有淋巴細胞增加的趨勢，類似于低輻射免疫功能增強的理論；而高劑量組則有明顯的淋巴細胞百分率下降，可能是低劑量照射出現即時增殖反應，高劑量輻射產生了輻射免疫功能抑制。是否在一定低劑量范圍內或短時間的輻射能夠增強免疫功能，有待進一步研究。在本實驗的低劑量和高劑量32P-GMS組之間有淋巴細胞的輻射損傷最大臨界值，超過此值淋巴細胞發生增殖抑制。外周血淋巴細胞主要為T淋巴細胞，其功能減弱將導致白細胞介素-2、干擾素-γ等細胞因子生成降低，自然殺傷細胞、細胞毒T淋巴細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞的殺傷能力下降，最終導致機體抗瘤功能下降。其機制是腫瘤細胞受到電離輻射后，FasL表達增強，激活的細胞毒T淋巴細胞也表達FasL，可通過Fas分子啟動致死性信號轉導，使表達Fas的細胞凋亡［10］。

放射治療是一個較為龐大的系統工程，涉及患者、設備、射線特征及與機體相互作用產生的生物效應，而這種生物效應的管理很重要［11］。放射性核素內照射治療在保證對實體瘤治療有效的前提下，更重要的是保證治療對象產生正向的生物效應，避免負向生物效應的危害，及內照射核素不泄漏到機體其他部位，避免對機體產生輻射損傷或影響機體免疫系統的功能；其次，玻璃微球不能代謝，當腫瘤組織經治療痊愈后，殘留的玻璃微球仍具有放射性，對周圍正常組織仍有輻照損傷，且已成為機體的異物，對機體的正常生理功能必將產生影響。可見，腫瘤內照射治療需要利用其局部照射的作用，與此同時，開發一種經過一段時間后可以被組織吸收代謝的生物材料作為載體將成為新的研究方向。

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［5］Zhang XR，Zheng L，Chen DF，et al.Efficacy of selective internal radioembolization with phosphorus-32glass microspheres combining with hepatic arterial em bolization on advanced liver Cancer［J］.Chinese J Hepatology，2003，11（6）：337.

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［11］蔡長青，廖萬清，劉文哲，等.放射治療質量保證的管理［J］.現代醫院，2006，6（12）：111-112.