免疫球蛋白G促進膠質瘤細胞系U87MG中PCNA P-ERK及P-SRC的表達

王 麗，滕曉梅，權翠俠，霍美鳳，胡書群（.江蘇省徐州市第一人民醫院檢驗科 00；.南京醫科大學基礎學院 009）

最近的一些研究顯示在多種腫瘤的細胞胞質中發現有免疫球蛋白（Ig）的表達，如人乳腺癌、大腸癌、胃癌等［1-4］。外源性IgG也可以引起中樞神經系統的免疫反應，雖然有關IgG的報道較多，但IgG的功能尚不清楚［5-6］。為此，本研究擬觀察人源性IgG刺激人膠質瘤細胞系U87MG，檢測其中增殖細胞核抗原（PCNA）、激活的非受體酪氨酸激酶（P-SRC）及激活的細胞外信號調節激酶（P-ERK）表達水平的變化，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 標本來源 以人源膠質瘤U87MG細胞系為研究對象。

1.2 培養過程 將U87MG細胞培養于10%胎牛血清的DMEM培養基中（內含青霉素和鏈霉素各10U／L），置于37℃、5%CO2培養箱中培養，取對數生長期細胞進行實驗。以5×103細胞／孔密度接種于96孔培養板中，培養24h，實驗孔分別加入以下濃度的人源性IgG 0.01、0.1、1μg／ml，每孔設3個復孔，分別培養24h。磷酸鹽緩沖液（PBS）作為陰性對照。

1.3 實驗方法 使用Western blot方法，檢測PCNA、P-ERK及P-SRC表達變化情況。外源性IgG刺激24h后，收集U87MG細胞，加入適量RAPI（含PMSF）裂解液，碾碎勻漿，離心提取總蛋白，按照BCA法測定總蛋白濃度，上樣量為每孔50μg總蛋白。按1∶4加上樣緩沖液后，95℃變性10min。100V恒壓10%十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，濕轉至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）。5%BSA封閉液室溫封閉1h，一抗（anti-mouse PCNA、p-ERK、ERK、P-SRC、SRC、GAPDH、santa cruz）按1∶1 000稀釋，4℃孵育過夜。0.05%TBST洗3次，每次5min。二抗為HRP標記的羊抗鼠IgG，37℃ 孵育1h。TBST 0.05%洗3次，每次5min。化學發光法檢測條帶，實驗重復3次。

1.4 統計學處理 Western blot條帶灰度值用Image J軟件進行分析，GAPDH作為PCNA的內參對照，總的SRC作為P-SRC內參對照，總的ERK作為P-ERK的內參對照，采用SPSS11.0統計軟件，數據差異統計學意義檢驗及采用方差齊性檢驗及單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 IgG刺激U87MG細胞24h后，PCNA蛋白表達水平的變化 PCNA蛋白表達在IgG刺激后有顯著性升高（圖1A）。在濃度為0.01μg／mL時，PCNA的表達沒有明顯變化；在IgG濃度為0.1μg／mL時PCNA的表達水平明顯升高，為對照組的2.51倍（P＜0.05）；當濃度為1μg／mL時，表達水平升高最為顯著，為對照組的3.56倍（P＜0.05，圖1B）。同時發現PCNA的升高與IgG濃度呈現劑量依賴性。

2.2 IgG刺激U87MG細胞24h后，P-SRC蛋白表達水平的變化 不同濃度的IgG都能增強P-SRC的表達（圖2A）。在濃度為0.01μg／mL時，P-SRC的表達就明顯升高，相對于對照組升高2.12倍（P＜0.05）；在IgG濃度為0.1μg／mL時P-SRC的表達水平為對照組的3.15倍（P＜0.05）；當濃度為1μg／mL時，表達水平升高最為顯著，為對照組的7.34倍（P＜0.05，圖2B）。發現P-SRC的表達水平與IgG濃度呈現劑量依賴性。

圖1 不同濃度IgG處理后PCNA的蛋白表達變化

圖2 不同濃度IgG處理后P-SRC蛋白表達的變化

2.3 IgG刺激U87MG細胞24h后，P-ERK蛋白表達水平的變化 不同濃度的IgG都能顯著地影響P-ERK的表達，隨著濃度的升高，P-ERK的表達水平逐漸上升（圖3A）。在濃度為0.01μg／mL時，P-ERK的表達水平就明顯升高，相對于對照組升高2.08倍（P＜0.05）；在IgG濃度為0.1μg／mL時PERK的表達水平為對照組的2.51倍（P＜0.05）；當濃度為1 μg／mL時，表達水平升高最為顯著，為對照組的5.87倍（P＜0.05，圖3B）。在濃度為0.01μg／mL和0.1μg／mL時P-ERK的表達水平并沒有明顯變化（P＞0.05），P-ERK的表達水平與IgG濃度呈現出一定的劑量依賴性。

圖3 不同濃度IgG處理后P-ERK蛋白表達的變化

3 討 論

IgG一直以來被認為是B淋巴細胞的特征性產物［7］。然而，IgG在非B細胞來源的上皮細胞表達已被多個實驗室證實。Qiu等［8］用原位雜交、免疫組化及Western blot等方法證實IgG在非B細胞來源的腫瘤細胞中表達，并提出癌細胞來源的IgG具有生長因子樣活性。

MAPK／ERK信號通路參與了細胞增長、發育、增殖、分化和細胞惡性轉化等多種生理、病理過程。Src激活后，能活化下游絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）途徑［9］。PCNA是一種重要的細胞周期蛋白，細胞的增殖離不開PCNA蛋白的作用，PCNA蛋白的表達減少會降低細胞的增殖活性［10］。本研究結果顯示，外源IgG刺激膠質瘤細胞系U87MG后，PCNA、PSRC及P-ERK表達水平升高，提示外源性的IgG促進了膠質瘤細胞系的進一步增殖。這與癌細胞及部分正常的上皮細胞來源的IgG具有促進腫瘤細胞生長的研究結果一致［8］。

在神經系統中，有研究發現正常腦脊液中IgG表達量較低，當中樞神經系統發生病變時，腦脊液中免疫球蛋白水平將有所增高，原因可能有兩種情況：（1）血腦屏障損傷后，IgG滲透性增高；（2）內源性IgG表達增加，即有鞘內IgG合成［11］。對于外源IgG在神經系統的作用研究較少，有研究發現外源IgG刺激新生大鼠皮層的原代混合膠質細胞，小膠質細胞和星型膠質細胞表現出活化狀態，提示了同種IgG在多種膠質細胞共存時仍主要引起小膠質細胞激活，并且星型膠質細胞也參與了對IgG的反應［12］。IgG的抗體體外對膀胱腫瘤細胞的生長具有一定抑制作用，且具有促進腫瘤細胞凋亡的效應［13］。有研究發現在大鼠黑質注射帕金森病患者的血清IgG，可導致多巴胺能神經元的損傷［5］。在大鼠隔區注射阿爾茨海默癥患者血清IgG，可導致膽堿能神經元的損傷、丟失［6］。這些實驗研究暗示了異種外源性IgG直接注射到CNS可引起CNS免疫損傷。

為進一步明確外源性IgG在神經系統疾病中的作用，還需要更多的實驗證據，期望外源性IgG能成為對中樞神經系統疾病診斷、治療一個新策略。

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