光鏡下突觸數——陽性突觸素顆粒數的體視學估計

彭 彬，林菁艷，楊正偉

(1.川北醫學院細胞化學研究室;2.川北醫學院附屬醫院麻醉科;3.川北醫學院形態定量研究室，四川南充 637000)

突觸是神經網絡中神經元之間或神經元與效應細胞之間信息傳遞的關鍵結構，其數量是反應神經系統發育及功能狀態的重要參數。突觸的可塑性，即一定條件下其形態(包括數量等)與功能的改變［1-2］，是近年來神經領域的研究熱點。發育、學習與記憶以及衰老與疾病可能伴隨突觸的生成與解離(突觸更新)［3-5］，從而引起突觸數量的改變，這是突觸傳遞效能可塑性的結構基礎，因此估計特定功能區域的器官組織內突觸數量的變化在疾病機制及藥效評價研究中具有重要意義。

突觸由突觸前成分、突觸間隙和突觸后成分組成，只有用電鏡才能清晰觀察。但電鏡切片(超薄切片)太薄，難以在切片內連續“斷層掃描”觀察突觸，因此我們必須采用多張連續電鏡切片根據物理體視框技術進行突觸數估計［6］。Tang 等［7-9］就用這樣的方法估計過突觸數。但這樣估計突觸數不僅要作連續超薄切片，還要在不同切片上的相同部位拍照、觀察并計數突觸;不僅要注意保證計數足夠數量的突觸，還要注意估計切片厚度(以估計體視框的高度)。這些都是比較困難的。

突觸的突觸前成分包括突觸前膨大和突觸前膜兩部分，在光鏡下為直徑約0.5 μm至數微米不等的紐扣狀結構，稱為終扣，內含大量突觸小泡［10］。人們發現，突觸小泡有一種分子量為38 KD的酸性鈣結合糖蛋白——突觸素(英文可縮寫成 SYP、SYN、p38)，它特異性地分布于突觸小泡的膜上，幾乎存在于中樞和外周神經系統的所有神經末梢［11-12］。由于突觸素的發現，人們從1985年開始采用組化技術在光鏡下顯示并觀察突觸——突觸素陽性顆粒，它實際上是成簇的突觸小泡［13］，因此，光鏡下觀察的突觸素顆粒數，可以反映突觸數。現在已有研究［14-16］用體視學方法在光鏡下估計突觸素顆粒數，并以此反映突觸數。例如，我們曾估計過大鼠脊髓背角內的突觸素顆粒數，發現坐骨神經切斷或松結扎所致神經病理性疼痛導致脊髓背角內突觸素顆粒數增加70%以上［15-16］。雖然突觸素顆粒數未必完全等于突觸數，突觸素顆粒數與突觸數之間的差異以及突觸素顆粒數與突觸傳遞功能的關系等尚需研究確定，但由于在光鏡下估計突觸素顆粒數遠比在電鏡下估計突觸數簡便得多，我們認為值得推廣運用。下面介紹光鏡下估計突觸素顆粒數的基本方法以及我們的經驗體會。

1 切片制備

1.1 切片與染色

石蠟切片或冰凍切片均可用于突觸素免疫組化染色［14-17］，其中石蠟切片是最常用、最基本的方法。根據標記物的不同，免疫組化常用的染色方法有免疫熒光法、免疫酶標法與親和組織化學法，后者敏感性更高，有利于微量抗原(抗體)在細胞或亞細胞水平的定位，其中抗生物素-生物素方法最常用［18］。

尤其要注意的是，封片劑有水溶性和油溶性兩種，由于水溶性封片劑不能長期保存且蓋玻片容易脫落。因此，最后封片要用油溶性封片劑，國內常用的是中性樹膠。用它封片后切片將干燥、固定，便于用油鏡觀察(見下面)。此外，與水溶性封片劑相比，中性樹膠與鏡油的折光率更一致［19］，這樣才能更準確的測量體視框的高度(見下面)。

1.2 切片厚度

突觸素顆粒呈棕黃色的顆粒狀、點狀或圈狀(圖1、圖2)。根據我們的測量，其直徑為0.6～1.5 μm(平均約0.9 μm)。因此，從利于辨認與計數的角度考慮，我們以為實際測量(用于突觸素顆粒計數)的切片厚度不宜小于3 μm。考慮到切片上表面約1 μm的組織可能凹凸不平、存在組織破壞甚至染色不佳，因此我們不計數這個厚度(監視厚度)的切片組織，而從其下面的聚焦平面開始計數。又考慮到切片厚度的變異［20］，實際觀測切片(染色后的切片)的厚度應不宜小于5 μm。再考慮到切片染色過程中的切片壓縮［20］，石蠟切片的厚度(切片機設定的切片厚度)可能不宜小于7 μm。

我們曾用石蠟切片染色顯示突觸素顆粒，切片機設定的切片厚度是14 μm，由于切片、染色過程中的切片壓縮，最后實際觀測切片的厚度約為10 μm。突觸素顆粒染色可穿透整個這個厚度的切片，即整個切片厚度內均可見陽性突觸素顆粒［15-16］。

2 突觸素顆粒計數

突觸素顆粒計數的基本方法是光學體視框，其基本方法如下［6］:用油鏡攝取圖像，在電腦顯示屏上觀察;均勻隨機抽選測試視野，在視野上疊加一定數量的測點和禁線框(圖1、圖2);先在切片的上表面聚焦，然后手動向下移動一定距離(監視厚度)，從此聚焦平面開始，再向下連續聚焦一定距離(計數厚度)的切片組織，邊聚焦邊觀察并計數(這個厚度的切片組織內)禁線框“內”新出現的突觸素顆粒(圖1、圖2)。這里，計數顆粒的空間即體視框，其底面積為禁線框的面積，高為用于計數的切片組織的厚度(計數厚度)。通過上下移動油鏡而在厚切片內連續觀察的聚焦平面即光學切片(不是用切片機切的物理切片)，因此這種技術叫光學體視框。

應注意:①用光學體視框的計數既要用油鏡，也要用中性樹膠封固切片。用油鏡不僅僅是為了能清晰地連續“斷層掃描”觀察切片及結構，也是為了更準確的測量光學切片的移動距離(體視框高度)，因為鏡油(與空氣相比)的折光率與切片組織(樹膠封固)的折光率更一致［19］，這樣測量的載物臺(或油鏡)移動距離才更準確的反映體視框高度。②為估計用于顆粒計數的體視框的數量或總體積，在每個視野上要定義一定數量的測點，并計數位于所測組織區域內的測點數，以此估計用于顆粒計數的所測組織(體視框)的總體積［6］。

3 突觸素顆粒數估計

用于計數突觸素顆粒的禁線框有一定面積a，將之乘以體視框高度h以及所用禁線框總數n(根據測點計數估計，見上述)，即得體視框的總體積V(V=a×h×n)。結合所計數到的突觸素顆粒總數Q-，即可估計所測組織內突觸素顆粒的數密度NV(=Q-/V)。再結合所測器官組織(經一系列組織處理后的器官組織)的總體積V’，即可估計所測器官組織內的顆粒總數N(=NV×V’)。

吳亮生等［14］曾用這種方法估計過大鼠松果體內的突觸素顆粒總數。這種方法中，處理后器官組織的體積V'估計較難［6］。為避免估計這個體積，我們可采用分合法(結合光學體視框)進行估計［6］，也可在計數突觸素顆粒的同時，計數數量較穩定的神經元的數量，以突觸素顆粒和神經元數量之比反映突觸素顆粒總數［15-16］，見下面的實例。

4 實例:L5節段脊髓背角內突觸素顆粒數的估計

4.1 切片制備

4月齡SD大鼠1只，作左側坐骨神經松結扎［15］，28 d后用4%多聚甲醛經心臟進行灌注固定，然后打開椎管并根據脊神經根的位置沿垂直于脊髓長軸的方向切取脊髓腰膨大(L4～L6)。用4%多聚甲醛浸潤固定(后固定)腰膨大24 h，用70%乙醇脫水2 d，然后沿垂直于脊髓長軸的方向將腰膨大均勻切分成6塊(每塊約2 mm厚)，取其中第3或第4塊(即中間2塊中的1塊)做石蠟包埋。(之所以只取1塊，一方面是為了減少工作量，另一方面是因為這其中1塊是坐骨神經在脊髓的主要投射區域。)從石蠟包埋的組織塊連續切取30張14 μm厚的連續切片(脊髓橫斷面切片)，從中等距隨機抽選5張(第1張切片從第1～6張連續切片中隨機抽選，以后每6張抽選1張)用于甲苯胺藍染色，另等距隨機抽選5張用于突觸素免疫組化染色。切片、裱片過程中特別注意了脊髓切片的頭尾側或左右側方向。

4.2 染色方法

甲苯胺藍染色方法:常規脫蠟至水后，切片放入57℃的0.01%甲苯胺藍溶液中染色5 min，再經95%乙醇分色1 min，常規脫水、透明及中性樹膠封片。

突觸素免疫組化染色方法:常規脫蠟至水后，切片放入3%H2O2孵育10 min，再經熱抗原修復，山羊血清封閉15 min，然后用突觸素(synaptophysin)的小鼠單克隆抗體(1∶200)孵育(4℃)過夜;接著依次用生物素標記的羊抗鼠IgG和辣根酶標記鏈酶卵白素(S-A/HRP)各孵育(37℃)15 min，最后在室溫下用DAB顯色4 min，蘇木精復染4 min，常規脫水、透明、中性樹膠封片。

4.3 體視學估計

4.3.1 突觸素顆粒數估計 用體視學圖像系統(丹麥Visiopharm產品)觀測突觸素顆粒染色切片(5張)。先在4×物鏡下用光標圈定擬測的脊髓背角區域，然后用100×油鏡(UPlanSApo，NA 1.40)觀察切片，切片圖像在電腦顯示屏上的最后放大倍數為2 240。先設定視野抽樣面積(實測視野面積)為脊髓背角區域面積的0.5%，然后依次等距隨機抽選并觀察視野。在每個視野上疊加9個測點及4個禁線框(每個面積為57.62 μm2)，見圖1。先計數位于脊髓背角內的測點數，然后計數每個禁線框“內”的突觸素顆粒數:先在切片上表面聚焦，然后向下移動0.5 μm(監視厚度)，從此計數平面開始，手動向下連續聚焦7 μm(計數厚度)，同時觀察并計數在這7 μm厚的切片組織內禁線框里新出現的突觸素顆粒。

5張切片中，位于左側脊髓背角內的測點總數(P左)為404，背角里計數到的突觸素顆粒數()總共為694。右側脊髓背角內的測點總數(P右)為435，背角里計數到的突觸素顆粒數()總共為425。

每個測點所關聯的體視框的體積(VP)為179.26μm3=(4×57.62×7/9)μm3。左側脊髓背角內突觸素顆粒的數密度:

5張切片左側脊髓背角區域的總面積A左為:(P左×4×57.62/9)/0.5% =2.07 mm2，因此左側脊髓背角區域橫斷面的平均面積為 0.41 mm2(=A左/5)。基于此，單位長度(例如每毫米長)脊髓的左側脊髓背角內的突觸素顆粒總數為:

NL(左)=NV(左)×=3.93×106(mm-1)

同樣地，單位長度右側脊髓背角內的突觸素顆粒總數為:

NL(右)=NV(右)×=2.45×106(mm-1)

鑒于新鮮脊髓組織在固定、脫水、染色、封片等步驟中會縮短約43%［15-16］，因此單位長度新鮮脊髓的左側脊髓背角內的突觸素顆粒總數為:

NL(左)×(100%-43%)=2.24×106(mm-1)

單位長度新鮮脊髓的右側脊髓背角內的突觸素顆粒總數為:

NL(右)×(100%-43%)=1.40×106(mm-1)

4.3.2 神經元數估計 如上所述，用體視學圖像系統觀測甲苯胺藍染色切片(5張)。不過，這里計數的是脊髓背角內的神經元細胞核的核仁，每個視野只測了1個面積為2 074 μm2的禁線框，實測視野面積為脊髓背角面積的5%。

5張切片里，位于左側脊髓背角內的測點總數(P左)為576，背角里計數到的神經元(核仁)數()總共為105。右側脊髓背角內的測點總數(P右)為543，背角里計數到的神經元(核仁)數()總共為108。

根據上述計算方法，單位長度脊髓(處理后，非新鮮)的左側脊髓背角內的神經元總數為60.00×103(mm-1)，單位長度(處理后)右側脊髓背角內的神經元總數為61.71×103(mm-1)。

4.3.3 突觸素顆粒與神經元數量之比 把處理后左側單位長度脊髓背角內的突觸素顆粒總數，除以處理后左側單位長度脊髓背角內的神經元總數，即得左側脊髓背角內突觸素顆粒與神經元數量之比為65.50。同樣獲得右側脊髓背角內突觸素顆粒與神經元數量之比，結果為39.70。這兩個(左側與右側)結果說明了左側坐骨神經松結扎使左側腰膨大脊髓背角內的突觸素顆粒數增加了65%(與右側相比)。對此項結果解釋說明:假設坐骨神經松結扎在不同動物的左、右兩側交替進行，假設65.50和39.70分別為結扎側與對側(對照)的平均結果(突觸素顆粒與神經元數量之比)且差異有統計學意義，那么這兩個結果說明坐骨神經松結扎使結扎側腰膨大脊髓背角內的突觸素顆粒數增加了65%(與對側相比)。這是因為，假設坐骨神經松扎術不會影響任一側脊髓背角內神經元的數量，那么任一側脊髓背角內突觸素顆粒與神經元數量之比的增減即突觸素顆粒數的增減［15-16］。

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