薯蕷皂苷對膠原性關節炎大鼠的免疫調節

褚春民,陳 放,張洪泉,卜 平

(1.揚州大學醫學院診斷學教研室;2.揚州大學醫藥研究所;3.揚州大學中西醫結合研究所,江蘇揚州,225001)

類風濕關節炎(RA)是一種常見全身性自身免疫疾病,以關節及其周圍組織炎癥為特征,以慢性、多發性、對稱性關節腫痛為主要表現。發病機制尚未明確,因而缺乏真正有效且副作用小的治療藥物[1]。穿山龍又名穿龍薯蕷、穿地龍、雞骨頭、狗山藥,為薯蕷科多年生藤本植物穿山龍薯蕷的根莖,主要產于中國遼寧、吉林、黑龍江、河北等地區。中醫認為其具有舒筋活血,止咳化痰,祛風止痛,可用于腰腿疼痛、筋骨麻木、跌打損傷、閃腰、咳嗽喘息、氣管炎等,均有明確療效[2]。穿山龍含多種生化成分,如薯蕷皂苷(dioscin),纖細薯蕷皂甙(gracillin),穗菝葜甾甙(asperin),25-D-螺甾-3,5-二烯(25-D-spirosta-3,5-diene)及對羥基芐基酒石酸(piscidic acid)等,其中薯蕷皂苷含量最多,藥用價值最大。作者從免疫功能方面探討薯蕷皂苷對膠原性關節炎大鼠的預防和治療作用,為其進一步臨床應用尋找實驗和理論依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

健康成年雄性SD大鼠60只,由揚州大學醫學院動物中心提供,許可證號SYXK(蘇)2002-0045,體質量(180±20)g。動物保護、使用和所有程序都按照動物倫理委員會的要求操作。大鼠于實驗前適應性飼養1周,自然光照,控制室溫20～22℃,并給予充足的標準飼料和飲用水。

1.2 藥物與試劑

薯蕷皂苷,單體,分子式C45H72O16,由浙江中醫藥大學中藥炮制中心提供,純度95%;不溶于水,可溶于0.5%CMC-Na;吲哚美辛片(河南太龍藥業股份有限公司,臨用前用0.5%CMCNa配成8 mg/kg);雞Ⅱ型膠原(CCII)、弗氏完全佐劑(FCA)(美國 Sigma公司);RPMI-1640(美國Gibco公司);D-Hanks液,參照文獻自行配制;IL-1、TNF-αELISA檢測試劑盒購買于武漢博士德生物工程有限公司;刀豆蛋白A、MT T:美國Sigma公司。

1.3 儀器設備

YLS-7B足趾容積測量儀,淮北正華生物儀器設備有限公司;751型紫外分光光度計,上海成光儀器有限公司;THERMO Multiskan FC全自動酶標儀,北京平利洋公司;TGL19臺式高速冷凍離心機,諾基儀器公司產品;LRH-250A生化培養箱,廣東省醫療器械廠;BP110S型電子天平:德國Sartorins產品。

2 實驗方法

2.1 CIA模型大鼠的造模方法與實驗方案

2.1.1 大鼠CIA模型的制備:制備CCII乳劑(終濃度為1 g/L)。用容積法測定正常大鼠雙后肢足初始容積(mL)后,將該乳劑于每只大鼠的右后足趾皮內注射0.1 mL致敏。第7天于尾根部近1/3處皮內注射該乳劑0.1 mL作為激發注射。正常對照組大鼠注射同等體積的生理鹽水[3]。

2.1.2 實驗分組及給藥方案:取健康雄性SD大鼠,隨機分為6組,設置正常對照組、模型組、陽性對照組、薯蕷皂苷(30、60、120 mg/kg)組。從第12天開始CIA大鼠灌胃給藥,連續14 d,陽性對照組給予吲哚美辛(IND,8 mg/kg),正常對照組和CIA模型組給予0.5%CMC-Na。并分別于造模后第12、18、24、30天用足容積測量儀測量大鼠非致炎足(左足)的容積,求出致炎前后足容積的差值即足腫脹度(△mL=致炎后容積-致炎前容積),以此觀察Dioscin對CIA大鼠繼發性關節腫脹的影響。

2.2 免疫臟器稱重

造模后第30天處死大鼠,打開胸腔和腹腔,剝離胸腺和脾臟后立即用電子分析天平稱重,各鼠胸腺、脾臟重量與其體重比值即為該鼠的胸腺指數和脾臟指數。以此觀察Dioscin對CIA大鼠免疫器官的影響。

2.3 脾淋巴細胞增殖反應檢測

造模后第30天處死大鼠,參照文獻[4]制備大鼠脾細胞懸液,調整細胞濃度為1×109/L。于96孔培養板上每孔加入脾細胞懸液100 μ L,再加入 100 μ L 的含 ConA(終質量濃度 5 μ g/mL)的RPM I-1640培養液,3個復孔,37℃、5%CO2培養箱培養48 h,終止培養前4 h每孔加入5 g/L MTT 10 μ L振蕩后繼續培養,離心棄去上清,加酸化異丙醇 120 μ L,于酶標儀 570 nm處測D值,結果取3個復孔D的均值。

2.4 腹腔巨噬細胞吞噬功能的檢測[5]

大鼠處死后,常規制備大鼠腹腔巨噬細胞,用RPMI-1640培養液調整細胞濃度至1×109/L,采用中性紅法測定大鼠腹腔巨噬細胞的吞噬能力,結果以酶標儀570 nm處D均值表示。

2.5 巨噬細胞 IL-1、TNF-a水平的檢測

同2.4項制備巨噬細胞,24孔培養板,每孔加入巨噬細胞懸液1 mL,37℃、5%CO2培養箱中培養2 h,棄去培養液,D-Hanks洗滌 3次,獲單層巨噬細胞,再加入1 mL含ConA(終質量濃度 5 μ g·mL-1)的 RPM I-1640 培養液 ,培養 48 h離心收集上清液,按ELISA檢測試劑盒說明書檢測IL-1和TNF-a的含量。

3 實驗結果

3.1 薯蕷皂苷對CIA大鼠繼發性關節腫脹的影響

與正常對照組比較,CIA模型組致炎后第12、18、24、30天繼發側足腫脹度與正常組比較明顯增加(P<0.01);薯蕷皂苷(60、120 mg/kg)及IND用藥第24、30天可減輕CIA大鼠的足腫脹度,與模型組相比有明顯差異(P<0.01);薯蕷皂苷(30 mg/kg)用藥30 d可減輕CIA大鼠的足腫脹度,有顯著性差異(P<0.01),(表1)。

表1 薯蕷皂苷治療對CIA大鼠足爪容積的影響(n=10)

3.2 薯蕷皂苷對CIA大鼠臟器指數的影響

實驗結果表明,CIA大鼠胸腺、脾臟指數與正常對照組相比明顯增大,差別有顯著意義(P<0.01,P<0.05)。Dioscin各劑量組與IND陽性組均能降低CIA大鼠胸腺指數,差異顯著(P<0.01,P<0.05)。但Dioscin各劑量組脾臟指數與模型組相比,差別無顯著意義(P>0.05),見表2。

表2 薯蕷皂苷治療對CIA大鼠胸腺指數和脾指數的影響(n=10)

3.3 薯蕷皂苷對CIA大鼠淋巴細胞增殖反應和

腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響

與正常對照組比較,CIA大鼠淋巴細胞增殖反應和腹腔巨噬細胞吞噬能力明顯降低,有顯著性差異(P<0.05);薯蕷皂苷(60、120 mg/kg)及IND陽性組均能提高CIA大鼠淋巴細胞增殖反應和腹腔巨噬細胞吞噬能力,差異顯著(P<0.05)。薯蕷皂苷(30 mg/kg)與CIA模型組比較無顯著性差異(P>0.05),見表3。

3.4 血清 IL-1、TNF-α的檢測

無菌摘取眼球取血,分離血清,0.45μm微孔濾膜過濾除菌。-20℃保存待測細胞因子。IL-1、TNF-α含量測定采用ABC-ELISA法,按說明書要求操作。結果顯示:CIA大鼠血清中IL-1和TNF-α水平明顯高于正常對照組(P<0.01)。薯蕷皂苷各劑量組及IND陽性組可劑量依賴性降低CIA大鼠 IL-1和 TNF-α的含量,使過度分泌IL-1和TNF-α的功能得到不同程度的恢復(P<0.05或P<0.01),見表4。

表3 薯蕷皂苷對CIA大鼠淋巴細胞增殖反應和腹腔巨噬細胞吞噬能力的影響(n=10)

表4 薯蕷皂苷對C IA大鼠血清IL-1、TNF-α含量的影響(n=10)

4 討 論

類風濕性關節炎又稱類風濕,目前公認類風濕關節炎是一種自身免疫性疾病。可能與內分泌、營養、地理、職業、心理和社會環境的差異、細菌和病毒感染及遺傳因素等方面有關系,以慢性、對稱性、多滑膜關節炎和關節外病變為主要臨床表現,屬于自身免疫炎性疾病。該病好發于手、腕、足等小關節,反復發作,呈對稱分布。早期有關節紅、腫、熱、痛和功能障礙,晚期關節可出現不同程度的僵硬畸形,并伴有骨和骨骼肌的萎縮,極易致殘。從病理改變的角度來看,類風濕性關節炎是一種主要累及關節滑膜(以后可波及關節軟骨、骨組織、關節韌帶和肌腱),其次為漿膜、心、肺及眼等結締組織的廣泛性炎癥性疾病。類風濕性關節炎的全身性表現除關節病變外,還有發熱、疲乏無力、皮下結節、胸膜炎、動脈炎、周圍神經病變等。廣義的類風濕性關節炎除關節部位的炎癥病變外,還包括全身的廣泛性病變。目前藥物治療主要包括非甾體抗炎藥、慢作用抗風濕藥、免疫抑制劑、糖皮質激素、生物制劑及植物藥等。主要作用體現在抑制自身免疫反應,減緩病情的發展。但各種西藥治療只能止痛,不能治痛,長期服用易產生依賴性和毒副作用,尤其是這些方法治療方法對人體的腎臟影響太大。免疫抑制劑雖然有明確的療效,但由于其具有較大的毒副作用,臨床應用受到一定的限制。所以尋找治療效果明確、毒副作用小的傳統中藥,如穿山龍及其提取物薯蕷皂苷等,并對其進行深層次的研究和探索,具有廣闊的應用前景和效益。

自Trentham等[6]首次用小牛二型膠原(CII)誘導動物關節炎成功以來,由于該關節炎病理過程與RA相似,有關CII免疫特性的研究已經非常細致和深入,是篩選和研究治療RA藥物的理想模型之一。本研究用異源性CCII造模,大鼠在致敏后等14 d足出現關節腫脹,第22天腫脹達高峰,并伴有前肢關節明顯紅腫、繼發性的多發性末端關節炎,耳部出現紅斑、尾部有串珠狀結節形成,這些與文獻報道基本一致[7]。推測原因可能與抗原抗體復合物的參與、補體活化及遲發型超敏反應等因素有關。實驗結果顯示,從第24天起薯蕷皂苷組可明顯減輕關節炎癥程度,促進CIA大鼠胸腺指數的恢復,抑制其滑膜增生和軟骨破壞,表明薯蕷皂苷對CIA大鼠具有治療作用,其對關節炎的治療作用可能與上述機制有關。

胸腺(thymus)為機體的重要淋巴器官。其功能與免疫緊密相關,分泌胸腺激素及激素類物質,具內分泌機能的器官。對 T淋巴細胞的發育成熟具有極為重要的意義。其分泌的胸腺素能使免疫缺陷病人的T細胞機能得到恢復,可誘導無胸腺及去胸腺小鼠的T細胞機能,脾臟是機體最大的免疫器官,占全身淋巴組織總量的25%,含有大量的T淋巴細胞、B淋巴細胞和巨噬細胞,是機體細胞免疫和體液免疫的中心。測定ConA誘導的小鼠淋巴細胞增殖的強弱,能反應藥物對T淋巴細胞增殖的影響[8],脾臟切除導致細胞免疫和體液免疫功能的紊亂,影響類風濕的發生和發展。胸腺和脾臟相對質量的變化已被廣泛用于評價機體的整體免疫狀態。藥物對動物胸腺、脾臟質量的影響,亦可作為免疫藥理機制的指標之一[9]。本研究發現,薯蕷皂苷對胸腺質量有明顯降低作用,但對脾臟質量作用較小,表明薯蕷皂苷對中樞免疫器官有作用,對外周免疫器官無明顯影響,可能通過減輕胸腺質量來發揮免疫調節作用。

巨噬細胞是機體的重要屏障,參與非特異性防衛(先天性免疫)和特異性防衛(細胞免疫)。它們的主要功能是以固定細胞或游離細胞的形式對細胞殘片及病原體進行噬菌作用(即吞噬以及消化),并激活淋巴細胞或其他免疫細胞,令其對病原體作出反應。還可分泌多種生物活性物質以及多種酶類物質,其中生物活性物質又稱巨噬細胞源性生物因子,包括多肽轉換生長因子、白細胞介素、腫瘤壞死因子、血小板衍生生長因子以及一氧化氮等;酶類物質主要包括膠原酶、彈性蛋白酶、纖溶酶原激活劑等;這些生物活性物質直接引導著機體修復的整個進程。在機體產生特異性細胞和體液免疫之前發揮防御作用。IL-1由單核細胞、內皮細胞、成纖維細胞和其他類型細胞在應答感染時產生的細胞因子。有 IL-1α和 IL-1β2種類型,都與免疫球蛋白超家族的同一受體結合。能刺激集落刺激因子、血小板生長因子等細胞因子的產生和使T細胞產生白介素-2,在免疫應答和組織修復中起作用,是保障機體正常免疫功能的關鍵環節。TNF-a在類風濕關節炎的病理過程中發揮著獨特而復雜的作用,如在體外可使軟骨和骨發生退行性變;在滑膜和關節軟骨連接處TNF-a與其受體同時存在;在培養的RA來源的滑膜細胞(淋巴細胞,巨噬細胞,樹突狀細胞,B細胞和內皮細胞以及成纖維細胞中調節IL-1產生的中樞作用[10],TNF-a能誘導其他細胞產生更加廣泛的致炎物質,很明顯它是一種炎癥反應成分。TNF-a還可與IL-1協同誘導RA患者滑膜巨噬細胞分化成破骨細胞[11]。

實驗結果顯示,CIA大鼠血清IL-1和TNF-a的水平明顯高于正常組,薯蕷皂苷體內給藥可劑量依賴性降低CIA大鼠胸腺指數,提高淋巴細胞增殖反應、增強腹腔巨噬細胞吞噬功能,抑制IL-1和TNF-a的生成。提示薯蕷皂苷發揮治療作用可能與其調節免疫功能、抑制巨噬細胞分泌炎性細胞因子有關。

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