國標法測定總氮中有關(guān)時間因素影響分析

● 太原市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢驗測試所 周煒環(huán)

實驗部分

1.儀器與試劑

儀器：雙光束紫外分光光度計，LDZX-30KBS手輪式自動型不銹鋼立式壓力蒸汽滅菌器，25mL具塞磨口玻璃比色管，10mm石英比色皿。試劑：硝酸鉀（GR），過硫酸鉀（GR），氫氧化鈉（AR）。

2.實驗原理

在120℃～124℃下，堿性過硫酸鉀溶液使樣品中含氮化合物的氮轉(zhuǎn)化為硝酸鹽，采用紫外分光光度法于波長220nm和275nm處，分別測定吸光度A220和A275，按公式(1)計算校正吸光度，總氮(以N計)含量與校正吸光度A成正比。

3.分析步驟

（1）標準曲線的繪制

分別量取0.00mL、0.20mL、0.50mL、1.00mL、3.00mL和7.00mL硝酸鉀標準使用液于25mL具塞磨口比色管中，其對應(yīng)的總氮(以N計)含量分別為0.00μg、2.00μg、5.00μg、10.0μg、30.0μg和70.0μg。加水稀釋至10.00mL，再加入5.00mL堿性過硫酸鉀溶液，用紗布扎緊管塞以防彈出。將比色管置于壓力滅菌器內(nèi)，加熱至頂壓閥吹氣，關(guān)閥，繼續(xù)加熱至120℃，保持120℃～124℃，消解30min。自然冷卻，取出比色管冷卻至室溫并搖勻。每個比色管分別加入1.0mL鹽酸溶液，用水稀釋至25mL，蓋塞搖勻，用10mm石英比色皿上紫外分光光度計，以水作參比，于波長220nm和275nm處測定吸光度值。

式中：

Ab為零濃度（空白）溶液的校正吸光度；

As為標準溶液的校正吸光度；

Ar為標準溶液校正吸光度與零濃度（空白）溶液校正吸光度的差值。

（2）樣品測定

量取10.00mL試樣(適量樣品用氫氧化鈉或硫酸溶液調(diào)節(jié)pH值至5～9)于25mL具塞磨口玻璃比色管中，按照“（1）”步驟進行測定。

（3）空白試驗

用10.00mL水（無氨水）代替試樣，按照“樣品測定”步驟進行測定。

結(jié)果與分析

HJ636-2012中，要求校準曲線的相關(guān)系數(shù)大于0.999；每批樣品至少做一個空白試驗，且其校正吸光度Ab＜0.030；每批樣品至少測定10%的平行雙樣，樣品數(shù)量少于10時，至少測定一個平行雙樣。當樣品總氮含量≤1.00mg/L時，測定結(jié)果相對偏差應(yīng)≤10%；當樣品總氮含量＞1.00mg/L時，測定結(jié)果相對偏差應(yīng)≤5%。

從以上要求可知，除了空白試驗吸光度和校準曲線相關(guān)系數(shù)決定測定是否達標外，測定結(jié)果相對偏差是否符合也很重要。由于總氮測定是將各種形態(tài)的氮都轉(zhuǎn)化為硝酸鹽氮來測定，因此整個測定過程中可能摻入的氮污染，都會影響測定結(jié)果，甚至總氮測定要在無氨的實驗室環(huán)境中進行。

1.過硫酸鉀溶液的存放時間對測定結(jié)果的影響

HJ636-2012中堿性過硫酸鉀溶液的配制：40.0g過硫酸鉀溶于600mL水中，另取15.0g氫氧化鈉溶于300 mL水中。待氫氧化鈉溶液溫度冷卻至室溫后，混合兩種溶液定容至1000mL，存放于聚乙烯瓶中，可保存一周。研究顯示，新配好的堿性過硫酸鉀溶液存放3天以內(nèi)，對總氮測定結(jié)果幾乎無影響；超過3天，測定結(jié)果會出現(xiàn)較小的負偏差；超過7天，將出現(xiàn)嚴重的負偏差。表1數(shù)據(jù)顯示，新配好的堿性過硫酸鉀溶液存放3天以內(nèi)的空白吸光度符合HJ636-2012中空白吸光度要求，但是當存放時間在3天時測定樣的相對誤差為7.2%，已經(jīng)超過HJ636-2012中當樣品總氮含量＞1.00mg/L時，測定結(jié)果相對偏差應(yīng)≤5%的質(zhì)控要求。相關(guān)專家認為，堿性過硫酸鉀溶液15℃左右存放超過6天即不可使用，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。表1數(shù)據(jù)表明，存放第3天開始，數(shù)據(jù)相對誤差開始超出質(zhì)控要求，當存放時間4天及以上時，空白吸光度超標。鑒于以上分析，為了保證測定數(shù)據(jù)能夠達標、有效，配好的堿性過硫酸鉀溶液最好在4℃環(huán)境中保存，且存放時間不應(yīng)超過2天，如果條件允許，最好現(xiàn)用現(xiàn)配。

表1 堿性過硫酸鉀溶液不同存放時間空白吸光度及10.00μg標樣測定結(jié)果

2.消解時間對測定結(jié)果的影響

HJ636-2012中，要求在壓力滅菌器達到120℃～124℃時消解30min。研究顯示，若消解時間不足，不但會使樣品內(nèi)的含氮物質(zhì)難以被完全氧化，而且會造成過硫酸鉀不能完全分解，這將導(dǎo)致空白溶液A220嚴重偏高。表2數(shù)據(jù)顯示，標準法規(guī)定的30min消解時間，不但其空白吸光度0.035大于質(zhì)控要求，而且4號標樣相對偏差大于5%，超出標準規(guī)定質(zhì)控要求，數(shù)據(jù)無效。當消解時間延長至40min，空白吸光度0.027符合質(zhì)控要求，但是4號標樣的相對偏差7.2%還是不符合質(zhì)控要求。相關(guān)專家建議消解時間至少控制在40min以上，以消除對空白吸光度和測定結(jié)果的影響。表2數(shù)據(jù)表明，當消解時間延長至50min甚至60min后，所測定的數(shù)據(jù)從空白吸光度和測定結(jié)果相對偏差兩方面都符合標準法(HJ636-2012)質(zhì)控要求，數(shù)據(jù)達標、有效。過硫酸鉀本身在波長為 220nm處有強烈的吸收，如果過硫酸鉀分解不完全，無論對空白吸光度還是對樣品的分析結(jié)果影響都很大。鑒于以上原因及數(shù)據(jù)分析，在消解時間的控制上，建議至少延長至50min（有條件的情況下，消解時間控制在60min左右更好），空白吸光度和測定結(jié)果相對偏差才能符合HJ 636-2012的質(zhì)控要求，數(shù)據(jù)達標、有效。

表2 不同消解時間空白吸光度及10.00μg標樣測定結(jié)果

3.消解后冷卻時間對測定結(jié)果的影響

HJ636-2012中規(guī)定，滅菌器在120℃～124℃條件下消解30min后，自然冷卻，開閥放氣，移去外蓋，取出比色管冷卻至室溫。以上內(nèi)容并未明確規(guī)定移去外蓋后，比色管的冷卻時間。但實踐中發(fā)現(xiàn)，除了要冷卻至室溫外，冷卻時間的取舍對空白吸光度以及測定結(jié)果也有不同程度的影響。通常在室溫中冷卻0.5h，比色管溫度完全可以降至室溫。但表3數(shù)據(jù)顯示，冷卻0.5h甚至1h，空白吸光度均大于0.030，不符合HJ636-2012質(zhì)控要求，數(shù)據(jù)超標、無效。當冷卻時間延長至1.5h，空白吸光度達到0.029，符合HJ636-2012空白吸光度質(zhì)控要求，但是4號標樣測定結(jié)果相對偏差達到9.2%，大于5%的質(zhì)控要求，數(shù)據(jù)無效。當冷卻時間延長到2h及以上時，無論是空白吸光度還是測定結(jié)果相對偏差都完全符合HJ636-2012中的質(zhì)控要求。綜上分析，為了保證數(shù)據(jù)準確度符合標準的質(zhì)控要求，建議樣品從壓力鍋內(nèi)取出后的冷卻時間延長到2h或以上。

表3 不同冷卻時間空白吸光度及10.00μg標樣測定結(jié)果

4.消解后冷卻方式對測定結(jié)果的影響

HJ636-2012中未對采取何種冷卻方式冷卻至室溫有明確規(guī)定，表4是滅菌器從壓力鍋中取出后，用冷水強制制冷0.5h的測定結(jié)果。該數(shù)據(jù)顯示，在冷卻過程中采取強制冷卻后，數(shù)據(jù)出現(xiàn)異常超標。建議在冷卻時不要采取任何強制制冷方式，只在空氣中自然冷卻至室溫。

表4 冷水強制制冷0.5h測定結(jié)果

圖1 正常情況下吸光度曲線

小結(jié)

為保證采用標準法（HJ636-2012）進行總氮測定數(shù)據(jù)能夠符合質(zhì)控要求，達標、有效，建議堿性過硫酸鉀溶液最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如果需要保存使用，最好在4℃條件下保存而且保存時間不要超過2天；在120℃～124℃條件下的消解時間延長到50min及以上；移出壓力滅菌器后冷卻時間至少保證2h并且在冷卻過程中不能采取任何強制制冷方式。