丁酸鈉通過下調細胞干擾素調節因子－1抑制鼻咽癌細胞CNE2吲哚胺－吡咯2，3－雙加氧酶的表達＊

郭芝剛，曾 軍，張錦宏，何玉文△

（廣州醫學院：1.基礎學院；2.第一附屬醫院藥劑科 510120）

研究表明，吲哚胺－吡咯2，3－雙加氧酶（indoleamine－pyrrole 2，3－dioxygenase，IDO）在腫瘤逃避免疫監視、腫瘤發生、發展中起著重要作用［1－2］。多種人腫瘤細胞和原發性腫瘤組織表達IDO，其抑制抗原特異性T淋巴細胞的增生，使腫瘤逃避機體的免疫攻擊［3－4］。研究發現，抑制IDO表達可以抑制自發性腫瘤的生長［5］，丁酸鈉（sodium butyrate，NaB）也能抑制IDO的表達，但機制不明確。本研究主要探討NaB抑制鼻咽癌細胞CNE2內IDO表達的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞株 CNE2細胞株為人鼻咽癌上皮細胞，由中山大學腫瘤醫院基礎部贈送。

1.1.2 試劑 試劑Soudim butyrade，購自Sigma公司；注射用重組人干擾素γ（IFN－γ），海雷泰，國藥準字S19990059；兔抗IDO抗體（中山大學微生物與生化制藥研究室制作）；β－肌動蛋白抗體（β－actin）購自北京博奧森生物技術有限公司；辣根過氧化物酶（HPR）標記的羊抗兔IgG購自Promega公司；SYBR Green PCR檢測試劑盒購自Toyobo公司；RPMI－1640培養基粉末購自美國Gibco公司；新生牛血清購自北京晨曦勇創公司。

1.2 細胞培養 CNE2細胞用含10%新生牛血清的RPMI－1640培養基，37℃，5%CO2條件下培養，以每孔3×105個接種6孔板，待細胞覆蓋率達60%～70%，加入NaB和（或）IFN－γ處理細胞。

1.3 Western blot免疫印跡檢測IDO的表達 取上述培養的細胞，加入2mmol／L NaB處理CNE2細胞0、6、12、24h后，加入100U／mL IFN－γ刺激24h后裂解細胞，進行蛋白定量，每孔20μg蛋白上樣，120V電壓進行10%SDS－PAGE聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，在100V，90min的條件下電轉，5%脫脂奶粉（TBST配制）封閉1.5h后，IDO抗體按1∶1 000的比例與封閉液混合，4℃過夜孵育電轉膜，TBST洗滌3次后，加入HPR標記的羊抗兔IgG二抗（1∶2 000），室溫搖床振蕩1h，TBST洗滌3次，加入ECL發光液后用X光片曝光。

1.4 RT－PCR檢測細胞因子信號抑制因子（suppress of cytokine signaling，SOCS）的轉錄 采用2mmol／L NaB和100U／mL IFN－γ同時處理CNE2細胞6h，Trizol抽提總RNA；42℃60min，95℃5min進行逆轉錄；以逆轉錄的cDNA為模板，94℃變性5min，94℃變性30s，SOCS1 44℃、SOCS3 51℃ 退火30s，72℃延伸45s，35個循環，最后72℃延伸10min，終止反應，進行PCR反應（表1）。

1.5 Real time PCR 檢測干擾素調節因子－1（interferon regulatory factor－1，IRF－1）的轉錄水平 取2mmol／L NaB，100U／mL IFN－γ單獨或同時處理CNE2細胞6h后，Trizol抽提總RNA；42℃60min，95℃5min進行逆轉錄；用25μL標準PCR反應體系檢測IRF－1的轉錄，25μL標準PCR反應體系：2×SYBR Green 12.5μL，PCR Forward Primer（10μmol／L）1 μL，PCR Reverse Primer（10μmol／L）1μL，DNA 模板 1～5 μL，加H2O到25μL。采用兩步法進行Real time PCR反應：步驟1：95℃30s，步驟2：95℃5 10s，60℃40s40個循環，反應結束后分析Real time PCR的擴增曲線、融解曲線和標準曲線。IRF－1引物F：ATG GCT GGG ACA TCA ACA AGG，R：CAT GGC ACA GCG AAA GTT GG。

表1 檢測SOCS1和SOCS3轉錄的引物

2 結 果

Western blot和RT－PCR檢測NaB對CNE2細胞IDO、SOCS1、SOCS3轉錄的影響（圖1～3）。結果顯示SOCS1和SOCS3的轉錄沒有顯著變化。提示兩者未參與NaB抑制IDO表達的信號傳導。NaB抑制IRF－1的轉錄，間接影響IDO的表達，見圖4。

圖1 Western－blot檢測結果NaB對CNE2細胞IDO表達的影響

圖2 RT－PCR檢測NaB及IFN－γ對CNE2細胞內SOCS1轉錄的影響

圖3 RT－PCR檢測NaB及IFN－γ對CNE2細胞內SOCS3轉錄的影響

圖4 Real time PCR檢測NaB及IFN－γ對CNE2細胞內IRF1轉錄的影響

3 討 論

NaB是由厭氧菌分解發酵結腸中未經小腸消化的食物中的糖類（主要是纖維和蛋白）產生的，是結腸上皮細胞主要的能量來源，能刺激結腸肽或生長因子的釋放，調節結腸黏膜血供，促進上皮細胞的增殖［6］。近來發現NaB能有效抑制腫瘤細胞增殖、誘導分化、促進凋亡的作用。NaB通過抑制組蛋白去乙酰化酶活性，導致組蛋白（非H1組蛋白H3、H4）高乙酰化，使組蛋白與相鄰DNA的接觸受抑制，改變了染色質的緊密結合，有利于轉錄因子激活特異性的基因，細胞分裂周期被阻滯于G1期，而達到NaB抗腫瘤的作用［7－8］。本研究發現NaB抑制IFN－γ誘導的IDO的表達。

IFN－γ調節基因的轉錄主要是通過Jak－STAT信號通路，其中有50多種細胞調節因子參與［9－10］。在IFN－γ未結合其受體時，IFN－γR1和IFN－γR2可能沒有密切的聯系。然而，最近研究發現在配體結合之前，IFN－γR1和IFN－γR2是裝配好的。當IFN－γ與其受體結合后，受體的胞內區開放，Jak2自身磷酸化，然后磷酸化激活Jak1，兩個Jak1可以形成一個招募STAT1同源二聚體的槽，STAT1二聚體接著被Jak2磷酸化，磷酸化后的STAT1二聚體從受體上脫離下來。IFN－γ激活其受體到STAT1二聚體從受體上脫離這一過程只需要1min就完成了。STAT1二聚體進入核內結合啟動子，誘導或抑制IFN－γ調節的基因。STAT1結合的元件有GAS和ISRE。IFN－γ誘導的第一批基因轉錄發生在15～30min之內。許多IFN－γ誘導基因是細胞內的轉錄因子，它們由IFN－γ誘導轉錄，接著調節下一批基因的轉錄［11－12］。

細胞因子是一類由細胞分泌的調節細胞生長、分化、增殖的多肽小分子，它們不能直接進入細胞內發揮作用，而是通過細胞因子受體介導，經相應信號傳導途徑發揮其生物學效應。SOCS是信號傳導通路JAK／STAT（Janus kinase／signal transduction and activators of transcription）的一個負性調控分子家族。SOCS家族有8個成員，每個成員都有一個中央SH2域，除了通常的蛋白質降解的泛素化機制，SOCS1和SOCS3能直接抑制JAK的酪氨酸激酶活性。

干擾素調節因子－1（IRF－1）是IFN－γ調節IDO表達通路上的關鍵因子，IRF－1通過IRF－E位調節靶基因的表達，IRF－E位的序列重疊于ISR－E的序列，此序列被ISGF3識別，其被Ⅰ型、Ⅱ型IFN－γ誘導［13］。在本研究采用Real time－PCR檢測了NaB和（或）IFN－γ作用下IRF－1的轉錄水平，發現IFN－γ作用下IRF－1的轉錄水平顯著增高，而NaB有效阻斷了IRF－1的轉錄，結果提示NaB對IFN－γ調節IDO表達抑制，可能是通過抑制IFN－γ的下游信號通路來實現的。

本研究證明了NaB通過抑制IRF－1的轉錄，從而抑制IDO表達的細胞內信號通路，為其在鼻咽癌治療的應用中提供了實驗依據，為以IDO為靶點的鼻咽癌的免疫治療提供一種新的策略。

［1］ 張文穎.IDO、樹突狀細胞與免疫耐受［J］.國際免疫學雜志，2006，29（6）：364－367.

［2］ 王慧，潘科，夏建川.IDO和CD4＋CD25＋調節性T細胞在腫瘤免疫逃逸中相互作用的研究進展［J］.癌癥，2009，28（2）：221－224.

［3］ Uyttenhove C，Pilotte L，Théate I，et al.Evidence for a tumoral immune resistance mechanism based on tryptophan degradation by indoleamine 2，3－dioxygenase［J］.Nat Med，2003，9（10）：1269－1274.

［4］ Munn DH.Indoleamine 2，3－dioxygenase，tumor－induced tolerance and counter－regulation［J］.Curr Opin Immunol，2006，18（2）：220－225.

［5］ Zeng J，Cai S，Yi Y，et al.Prevention of spontaneous tumor development in a ret transgenic mouse model by ret peptide vaccination with indoleamine 2，3－dioxygenase inhibitor 1－methyl tryptophan［J］.Cancer Res，2009，69（9）：3963－3970.

［6］ Blottiere HM，Buecher B，Galmiche JP，et al.Molecular analysis of the effect of short－chain fatty acids on intestinal cell proliferation［J］.Proc Nutr Soc，2003，62（1）：101－106.

［7］ Budillon A，Di Gennaro E，Bruzzese F，et al.Histone deacetylase inhibitors：a new wave of molecular targeted anticancer agents［J］.Recent Pat Anticancer Drug Discov，2007，2（2）：119－134.

［8］ Bi G，Jiang G.The molecular mechanism of HDAC inhibitors in anticancer effects［J］.Cell Mol Immunol，2006，3（4）：285－290.

［9］ Choi WH，Ji KA，Jeon SB，et al.Anti－inflammatory roles of retinoic acid in rat brain astrocytes：Suppression of interferon－gamma－induced JAK／STAT phosphorylation［J］.Biochem Biophys Res Commun，2005，329（1）：125－131.

［10］David M，Petricoin E，Larner AC.Activation of protein kinase a inhibits interferon induction of the Jak／Stat pathway in U266cells［J］.J Biol Chem，1996，271（9）：4585－4598.

［11］Heim MH，Kerr IM，Stark GR，et al.Contribution of STAT SH2groups to specific interferon signaling by the JAKSTATpathway［J］.Science，1995，267（5202）：1347－1349.

［12］Greenlund AC，Morales MO，Viviano BL，et al.STAT recruitment by tyrosine－phosphorylated cytokine receptors：an ordered reversible affinity－driven process［J］.Immunity，1995，2（6）：677－687.

［13］Tanaka N，Kawakami T，Taniguchi T.Recognition DNA sequences of interferon regulatory factor 1（IRF－1）and IRF－2，regulators of cell growth and the interferon system［J］.Mol Cell Biol，1993，13（8）：4531－4538.