MMP1，MMP2和TIMP2在雄附方干預大鼠肺間質纖維化中的作用

王 勇，楊永濱，馬玉琛

1解放軍醫(yī)學院/解放軍總醫(yī)院 中醫(yī)研究所，北京 100853；2河北大學基礎醫(yī)學院 病理教研室，河北保定 071000；3解放軍第252醫(yī)院 中醫(yī)康復科，河北保定 071000

肺間質纖維化屬于間質性肺疾病(interstitial lung disease，ILD)，可造成呼吸衰竭，甚至死亡[1]。肺間質纖維化是上皮細胞損傷和不良修復的結果。目前臨床上對肺纖維化的治療主要是應用糖皮質激素、免疫抑制劑/細胞毒藥物和抗纖維化藥物聯用或單用，但療效均不佳。經臨床實踐與動物實驗研究均證實傳統(tǒng)中藥制劑雄附方可有效治療繼發(fā)性肺纖維化[2]。本研究在前期研究成果的基礎上，通過觀察基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)中的MMP1與MMP2和內源性基質金屬蛋白酶組織抑制因子(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)中的 TIMP2，在雄附方干預博萊霉素誘導的肺間質纖維化大鼠模型肺組織中的表達水平，旨在進一步探討雄附方預防大鼠肺間質纖維化的作用機制。

材料和方法

1 主要儀器及試劑 光學顯微鏡及配套圖像采集與分析軟件(Olympus IX71和imagepro plus6.0)。注射用鹽酸博萊霉素(15 mg/支，粉劑)，日本化藥株式會社生產，批號870690)，用0.9%氯化鈉注射液稀釋成濃度為0.5%的博萊霉素注射液。兔抗大鼠MMP1、MMP2和TIMP2多克隆抗體(工作濃度1∶150、1∶150、1∶100 和 1∶100)、即用型 SPTM檢測試劑盒和濃縮型DAB顯色試劑盒均購自北京博奧森生物技術有限公司。自制雄附方(由雄黃粉0.1 g，制白附子粉1.2 g，僵蠶粉1.2 g組成)。醋酸潑尼松片(5 mg/片，片劑)天津太平洋制藥有限公司生產，批號H12020809。

2 實驗動物及分組 選擇SPF級SD雄性大鼠70只，6周齡，體質量(206±16) g，購自軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心，許可證號SCXK-(軍)2002-001，飼養(yǎng)環(huán)境溫度(25±1)℃，相對濕度50%~60%。隨機分為對照組(BC)，假手術組(PS)，纖維化模型組(MD)，醋酸潑尼松組(PN 5.6 mg/kg)，雄附方高、中、低劑量組(XFFH、XFFM和XFFL 1.4 g/kg、0.7 g/kg、0.35 g/kg)7組，每組10只。

3 肺纖維化大鼠模型制備及給藥 對照組以外的實驗大鼠均給予腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)，待大鼠麻醉后將其仰臥位固定在鼠臺上，以75%醫(yī)用酒精常規(guī)消毒皮膚、鋪巾；取頸部正中線剪開皮膚0.5 cm，以血管鉗鈍性分離逐層剝離暴露氣管，用4號針頭從氣管軟骨環(huán)間隙向心端刺入氣管，注入0.3 ml博萊霉素氯化鈉溶液(7.5 mg/kg)或0.9%氯化鈉注射液(假手術組)，再注入0.3 ml空氣，立即將動物直立并旋轉，使藥液在肺內均勻分布。再次消毒后縫合肌肉、皮膚。假手術組除注入氣管等量的0.9%氯化鈉注射液外，其他步驟相同。造模后第2天用0.9%氯化鈉注射液(0.014 L/kg)或相應藥物(混懸液0.014 L/kg)每天灌胃(ig)，每周連續(xù)給藥6 d，休息1 d，共給藥4周。給藥4周后斷頭處死，用手術剪和鑷子摘取雙肺，取部分右中肺組織，4%多聚甲醛溶液固定，常規(guī)石蠟包埋、切片。

4 檢測指標 免疫組織化學染色(SP)法檢測肺組織中MMP1、MMP2和TIMP2的表達水平。具體步驟參照相關試劑盒使用說明書。每組染色均設陽性對照(以已知MMP1、MMP2和TIMP2陽性的乳腺癌組織切片)和陰性對照(以0.01 mol/L PBS代替一抗)組切片染色。MMP1、MMP2和TIMP2的染色陽性定位為胞漿內，陽性細胞均呈棕黃色顆粒顯示，背景清晰無非特異性著色。本研究采用測量累積光密度(integrated optical density，IOD)值定性評價方法，評估各組肺組織中MMP1、MMP2和TIMP2的陽性表達水平及組間差異。具體操作：選取各組肺組織中每張切片400倍視野中5個有代表性不連續(xù)視野，將所選目的區(qū)域圖像經OlympusIX71光學顯微鏡及其自帶軟件imagepro plus6.0采集并測量其IOD值，每組共需測量和記錄50個IOD值，取均數后進行組間差異比較。本研究選取OD值越大代表目的蛋白陽性表達水平越高的OD值檢測體系。

5 統(tǒng)計學處理 所得數據結果以-x±s表示，采用SPSS16.0 for windows軟件包中單因素方差分析(oneway ANOVA)法進行多組間比較及兩兩比較，a=0.05。

結 果

1 MMP1的表達 MMP1以細胞漿呈棕黃色顆粒者為陽性細胞，背景清晰無非特異性著色。陽性細胞包括肺泡上皮細胞、間質成纖維細胞和部分炎細胞。比較MMP1在各組中的IOD值可以發(fā)現，MMP1在MD組陽性表達水平最高(455.16±39.08)；PN、XFFM和XFFL組MMP1的陽性表達強度均高于BC、PS和XFFH組(F=264.715，P＜0.05)；其中XFFH組表達水平最低(20.11±11.94)。見圖1、表1。

2 MMP2的表達 MMP2的陽性部位在肺泡上皮細胞、間質成纖維細胞和部分炎細胞的細胞漿。其蛋白表達水平在MD組陽性表達為各組之最(253.24±48.72)；PN、XFFM 和 XFFL組 MMP2的陽性表達強度均高于BC、PS和XFFH組(P＜0.01)，且差異均有統(tǒng)計學意義(F=168.58，P＜0.05)。其中XFFH組表達水平最低(33.59±17.32)。見圖1、表1。

3 TIMP2的表達 在肺泡上皮細胞、間質成纖維細胞和部分炎細胞的細胞漿中可見TIMP2呈陽性染色。MD組TIMP2蛋白陽性表達水平最高 (458.96±67.87)；PN、XFFM 和 XFFL 組 MMP1、MMP2和TIMP2的陽性表達強度均高于BC、PS和XFFH組，且差異均有統(tǒng)計學意義(F=217.48，P＜0.05)。其中BC組表達水平最低(21.37±15.47)。見圖1、表1。

討 論

現代醫(yī)學認為肺間質纖維化是多種原因引起的成纖維細胞增殖、MMPs/TIMPs系統(tǒng)平衡被破壞，大量細胞外基質聚集；發(fā)生過程與受損肺組織發(fā)生實質細胞變性壞死，局部炎細胞浸潤，氧自由基含量增加，間質支撐結構中的細胞外基質(extracellular matrix，ECM)成分早期被分解破壞，炎癥后期增生修復中局部新生成ECM在肺間質的沉積過多等因素和環(huán)節(jié)影響有關[3]。細胞外基質的含量變化與分泌ECM主要成分(如膠原纖維)的肌成纖維細胞數量增加相關，也與受損組織中蛋白水解酶的含量和活性有關。基質金屬蛋白酶(MMPs)基因激活后可直接降解基底膜和ECM。MMPs與特異性抑制劑TIMPs 特異性結合之后失活，含量比例平衡直接參與和影響ECM的代謝[4-5]。MMPs與特異性抑制劑TIMPs含量比例平衡，決定著ECM是否過量沉積于肺。

圖1 MMP1、MMP2和TIMP2在雄附方對抗博萊霉素誘導大鼠肺纖維化肺組織中的陽性表達(IHC染色，×400)MMP1： 1a: 正常對照組； 1b: 模型組； 1c: 醋酸潑尼松組； 1d: 雄附方高劑量組； MMP2： 2a: 正常對照組； 2b: 模型組； 2c: 醋酸潑尼松組； 2d: 雄附方高劑量組； TMMP2： 3a: 正常對照組； 3b: 模型組； 3c: 醋酸潑尼松組； 3d: 雄附方高劑量組Fig.1 Expressions of MMP1, MMP2 and TIMP2 in the lung tissue after treatment of bleomycin-induced pulmonary fibrosis with Xiongfufang(IHC staining, ×400)1a: MMP1 in NB; 1b: MMP2 in MD; 1c: MMP2 in PN; 1d: MMP2 in XFFH; 2a: MMP2 in NB； 2b: MMP2 in MD； 2c: MMP2 in PN;2d: MMP2 in XFFH; 3a: MMP2 in NB； 3b: MMP2 in MD； 3c: MMP2 in PN； 3d: MMP2 in XFFH

表1 雄附方對抗博萊霉素誘導大鼠肺纖維化4周時各組肺組織中MMP1，MMP2和TIMP2的表達Tab.1 Expression of MMP1, MMP2 and TIMP2 in different groups 4 weeks after treatment of bleomycininduced pulmonary fibrosis with Xiongfufang

研究結果顯示：造模4周后，MD組肺組織中MMP1、MMP2和TIMP2活性表達水平上升，肺組織纖維化程度重；發(fā)生機制可能是肺組織受損后，通過機體代償增多MMP1來降解ECM中的膠原纖維，增多MMP2降解明膠，局部TIMP2蛋白表達水平代償性升高，但不足以平衡MMP1、MMP2活性比例。雄附方高劑量組肺組織中的MMP1和MMP2表達水平明顯低于纖維化模型組和其他用藥組，TIMP2表達水平明顯高于對照組和假手術組；MMP1和MMP2在損傷后期表達呈下調趨勢可能與雄附方上調局部TIMP2的表達，造成晚期MMPs/TIMPs比值下降等因素有關；造成了局部受損組織在損傷后重建過程中ECM沉積減少，組織纖維化程度不明顯。TIMP2高表達的機制尚不清楚，可能與用藥前博來霉素造成早期局部肺泡上皮損傷，基底膜部分暴露后刺激MMPs表達水平上升等生物效應有關。醋酸潑尼松組肺組織中的MMP1和MMP2表達水平明顯低于肺纖維化模型組，但與對照組和假手術組比較明顯增高，差異存在統(tǒng)計學意義；與高劑量雄附方組比較，二者差異也有統(tǒng)計學意義。雄附方中、低劑量組肺組織中的MMP1、MMP2和TIMP2表達水平與醋酸潑尼松組相近，說明高劑量是干預肺間質纖維化形成的最佳劑量，為臨床用藥提供了依據。綜上所述，推測雄附方對抗肺組織纖維化機制可能與其有效平衡肺組織中MMP1、MMP2和TIMP2的表達水平有關。

1 King TE Jr， Pardo A， Selman M. Idiopathic pulmonary fibrosis［J］.Lancet， 2011， 378（9807）：1949-1961.

2 馬玉琛，楊永濱，王勇，等．雄附散阻抗大鼠肺間質纖維化的病理形態(tài)觀察［J］.武警醫(yī)學，2010，21（2）：131-134．

3 Yang K， Palm J， K?nig J， et al. Matrix-Metallo-Proteinases and their tissue inhibitors in radiation-induced lung injury［J］. Int J Radiat Biol， 2007， 83（10）：665-676.

4 Wynn TA. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis［J］. J Pathol， 2008， 214（2）：199-210.

5 Oggionni T， Morbini P， Inghilleri S， et al. Time course of matrix metalloproteases and tissue inhibitors in bleomycin-induced pulmonary fibrosis［J］. Eur J Histochem， 2006， 50（4）：317-325.