c-Jun氨基末端激酶1和2在角質形成細胞系Hacat細胞中的作用

羅 淵，陸承榮，王 喆，段連寧，向培德，孫麗亞

空軍總醫院 臨床航空醫學實驗室，北京 100142

人角質形成細胞是表皮的重要組成部分，不但可以產生角蛋白、形成角質層，構建完善的物理屏障；而且還可對部分抗原進行攝取和分解，并可產生多種細胞因子，參與皮膚免疫應答[1-2]。同時，它還是皮膚創傷修復的關鍵細胞，在促進傷口愈合、瘢痕形成以及再塑修復過程中起重要作用[3]。在炎性細胞因子和環境應激作用下，可導致JNK、ERK等通路的激活，并參與諸如皮膚老化、黑色素瘤、病毒感染等疾病的發生和發展[4-5]。絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases，MAPKs)是細胞內的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是真核生物信號傳遞網絡中的重要途徑之一，在基因表達調控和細胞功能活動中發揮關鍵作用[6]。MAPK有3個主要家族：ERK、JNK和p38MAPK。ERK通路主要參與細胞的增殖與分化，JNK通路和p38MAPK通路主要參與細胞的應激反應和凋亡[7]。其中，JNK由3個同工酶組成，即組織中廣泛表達的JNK1、JNK2，以及在心臟、睪丸和腦中特異表達的JNK3。近來有研究報道JNK1和JNK2的功能存在一定的差異性，但其在角質形成細胞中是否也存在差異仍不明確[8]。本研究以人角質形成細胞系—Hacat細胞為研究對象，通過敲低其JNK1或JNK2的表達，探討JNK1和JNK2的功能差異性。

材料和方法

1 細胞系 人Hacat細胞和293T細胞為本實驗室常規保存。Hacat細胞的全培養基為含1×人類角質形成細胞生長添加劑(HKGS)的專用培養基。293T細胞的全培養基為含10%特級胎牛血清的高糖DMEM。依據細胞濃度，每2~3 d換液或消化、傳代。

2 主要試劑與儀器 人類角質形成細胞生長添加劑(S0015)、專用培養基(M-EPI-500-CA)、含EDTA的胰酶(25200-072)、高糖DMEM(11965118)和轉染試劑Lipofectamine LTX(15338-100)均購自美國Invitrogen公司。特級胎牛血清購自北京元亨圣馬公司。穿梭質粒(plko.1)和包裝質粒(PMD2G、psPAX2)均購于美國Addgene公司。JNK1/2 siRNA的oligo序列由Invitrogen公司合成。CCK-8試劑盒(CK-04)購自日本同仁化學研究所。細胞周期檢測試劑盒(340242)和細胞凋亡檢測試劑盒(559763)均購自美國BD公司。主要儀器設備包括：細胞培養箱(MCO-15，日本三洋)、倒置相差顯微鏡(CK-3，日本奧林巴斯)、酶標儀(RT-6000，深圳雷杜生命科學股份有限公司)、流式細胞儀(FACS Calibur，美國BD公司)。

3 慢病毒法建立JNK1、 JNK2敲低細胞株及鑒定根據在線網站工具(http：//jura.wi.mit.edu/siRNAext)設計針對JNK1和JNK2的siRNA靶序列，將靶序列代入穿梭質粒的框架后送公司合成。分別將上下游oligo溶解后退火，與經EcoRI和AgeI雙酶切后回收的plko.1載體連接，并轉化感受態細胞，挑選成功的重組載體。將293T細胞鋪板，密度為7×105細胞/60 mm平皿，加入2 μg穿梭質粒和包裝質粒各1 μg進行共轉染，第2天換新鮮培養基，24 h后收獲病毒液，經0.44 μm過濾后分裝、凍存于-80 ℃。培養Hacat細胞，約5×105細胞/60 mm平皿，加入1 ml病毒液和3 ml全培養基，添加polybrene(8 μg/μl)，5 h后換新鮮培養基，48 h后加入嘌呤霉素(2 μg/μl)開始篩選。適當收獲一些細胞，裂解后進行JNK1、 JNK2的Western Blot鑒定。

4 CCK-8法檢測細胞增殖曲線 在96孔板中分別鋪Hacat細胞、JNK1和JNK2敲低細胞，每孔鋪104個細胞，檢測時間點設為0 h、18 h、36 h和54 h，每個時間點設3個復孔和3個空白對照孔(不加CCK-8)。到相應時間點時，向每個實驗孔中加入10 μl CCK-8，振蕩混勻后放回37 ℃孵箱再培養4 h，然后進行雙波長酶標儀檢測，主波長為450~490 nm，次波長為600~650 nm，以實驗孔OD值減去相應的空白對照孔OD值為最終結果。

5 流式細胞術檢測細胞周期 在6孔板中分別鋪Hacat細胞、JNK1和JNK2敲低細胞，每孔鋪4×105個細胞，每種細胞各做3個復孔。細胞貼壁后開始血清饑餓24 h，即換成只含0.5%血清的DMEM培養基。第2天，重新換成專用全培養基，啟動細胞增殖。24 h后胰酶消化細胞，收集后按BD細胞周期試劑盒進行染色，流式細胞儀檢測。

6 流式細胞術檢測細胞凋亡 在6孔板中分別鋪Hacat細胞、JNK1和JNK2敲低細胞，每孔鋪4×105個細胞，細胞貼壁后分別加入不同濃度的Taxol(0 nmol/L、100 nmol/L、200 nmol/L 和 400 nmol/L)，每個劑量點做3個復孔。藥物作用48 h后，收集細胞，按照BD凋亡檢測試劑盒說明書進行檢測。7 統計學分析 采用SPSS17.0軟件包進行統計學分析。單因素方差分析檢驗Hacat細胞、JNK1和JNK2敲低細胞的組間差異，q檢驗進行兩兩比較。

結 果

1 JNK1、JNK2敲低表達Hacat穩轉株的鑒定 分別構建JNK1、JNK2敲低的細胞株，JNK1(46 kU)敲低約50%，而JNK2(54 kU)幾乎完全敲除，結果見圖1，siRNA序列見表1。

表1 有效的針對JNK1/2的siRNA序列Tab.1 Sequences of JNK1/2 siRNA

2 JNK1/2敲低對Hacat細胞增殖的影響 在細胞培養早期(18 h)，三種細胞的增殖變化不明顯(P=0.626＞0.05)。培養中期(36 h)，三種細胞的增殖差異有統計學意義(P=0.000＜0.05)。經兩兩比較，對照組高于JNK1敲低組(P=0.000＜0.05)和JNK2敲低組(P=0.017＜0.05)，JNK2敲低組也高于JNK1敲低組(P=0.002＜0.05)。培養后期(54 h)，因未進行細胞換液，部分細胞死亡，故OD值下降，見圖2。

3 JNK1/2敲低對Hacat細胞周期的影響 三組細胞在G0/G1期的分布無統計學差異(P=0.245＞0.05)，而S期和G2/M期均有差異(P=0.000＜0.05)。兩兩比較發現，S期的JNK1敲低組低于對照組和JNK2敲低組(P=0.000＜0.05)，對照組和JNK2敲低組間無統計學差異(P=0.065＞0.05)。G2/M期的JNK1敲低組高于對照組和JNK2敲低組(P=0.000＜0.05)，對照組和JNK2敲低組間無統計學差異(P=0.088＞0.05)。可見，JNK1敲低使增殖期細胞顯著減少，細胞阻滯于G2/M期，而JNK2敲低對細胞周期影響不大，見圖3。

4 JNK1/2敲低對Hacat細胞凋亡的影響 在不同劑量點，組間比較均有統計學差異(P＜0.05)。兩兩比較發現，JNK2敲低組的凋亡率在每個劑量點都高于對照組和JNK1敲低組(P＜0.05)，而JNK1敲低組和對照組在100 nmol/L和400 nmol/L時差異不顯著，而在200 nmol/L時對照組凋亡率增高。表明JNK2抗凋亡作用高于JNK1，而JNK1可能有促凋亡作用，見圖4。

圖1 JNK1/2敲低效果的Western Blot鑒定(JNK1-46 kU、JNK2-54 kU)Fig.1 Western blot showing the knocked-down JNK1-46 kU and JNK2-54 kU

圖2 JNK1/2敲低對Hacat細胞增殖的影響(CCK-8法)Fig.2 CCK-8 assay showing effect of knocked-down JNK1/2 on proliferation of Hacat cells

圖3 JNK1/2敲低對Hacat細胞周期的影響(流式細胞術法)Fig.3 Flow cytometry showing effect of knocked down JNK1/2 on cell cycle of Hacat cells

圖4 JNK1/2敲低對Hacat細胞凋亡的影響(流式細胞術法)Fig.4 Flow cytometry showing effect of knocked-down JNK1/2 on apoptosis of Hacat cells

討 論

本研究利用慢病毒載體系統，成功構建了JNK1或JNK2敲低表達的Hacat穩定轉染細胞株，先后進行了細胞增殖、細胞周期和Taxol的凋亡誘導實驗，通過和正常Hacat細胞對比，發現培養36 h后，JNK1/2敲低時細胞增殖顯著減緩，尤以JNK1敲低更顯著。細胞周期結果表明，啟動培養24 h后，三組細胞在G0/G1期的分布無統計學差異，而S期和G2/M期均有統計學差異。其中，在S期JNK1敲低組明顯低于對照組和JNK2敲低組，而JNK1敲低組的G2/M期明顯高于其余兩組，可見JNK1敲低使增殖期細胞顯著減少，細胞阻滯于G2/M期，而JNK2敲低對細胞周期影響不大。凋亡誘導實驗表明，JNK2敲低組的凋亡率在每個劑量點都顯著高于對照組和JNK1敲低組，可見JNK2抗凋亡作用顯著高于JNK1，而JNK1甚至可能有促凋亡作用。初步表明，JNK1和JNK2的作用存在不同。在細胞增殖方面，JNK1作用強于JNK2；而在抗凋亡方面，JNK2作用強于JNK1。

目前，關于JNK的研究已較為深入，已發現MEK4和MEK7兩種直接上游激酶以及若干種下游 分 子， 如 c-Jun、ATF2、P53、Elk-1、c-Myc2、Bcl-2、Bim、BAD等[9]。Ke等學者的研究表明，在70%的人表皮細胞瘤中JNK2高度活化，而且通過藥物或基因方法抑制JNK2的活性可抑制腫瘤發生，可見JNK2的抗凋亡作用較大[8]。Liu等學者通過基因敲除小鼠也發現，TNF-α引起的凋亡在JNK1缺乏的成纖維細胞中受到抑制，而JNK2缺乏的反而增強，這與我們的研究結果一致[10]。而Zhong等學者研究發現，JNK1可磷酸化Elk-1而導致TBP表達增高，并最終促進增殖，而JNK2起抑制作用。相應地，JNK1缺失時，細胞增殖變緩，而JNK2缺失時，細胞增殖加快[11]。這與我們的結果部分一致，可能是由不同細胞或不同刺激類型所致。

JNK在細胞增殖、分化、凋亡中的作用機制錯綜復雜。不同的組織細胞來源、不同的刺激因素或不同的JNK同工酶，可激活不同的信號轉導通路[12]。大量的研究表明，JNK信號通路密切參與許多疾病的發生和發展，如腫瘤、神經系統疾病、免疫性疾病等，而且可能是某些疾病的治療靶點[13-15]。本研究發現JNK1和JNK2在人類皮膚角質形成細胞中存在不同的功能，尤其是抑制JNK2可以大大促進細胞凋亡，為皮膚疾病的相關研究打下了基礎。但也存在一些不足，如本研究未對原代細胞進行相應的驗證，而且沒有進行JNK1/2過度表達的研究，這也是我們后續的研究思路。

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