大孔吸附樹脂純化山橿總黃酮的工藝研究

陳隨清， 陳磊磊， 魏雅磊， 尚朝利

(河南中醫(yī)學(xué)院，河南鄭州 450008)

山橿Lindera reflexaHemsl.系樟科Lauaceae山胡椒屬植物，其根性溫、味辛，具有行氣止痛、健脾消積、活血消腫等作用［1-2］。在河南省民間用于治療慢性胃炎，胃潰瘍，有很長的應(yīng)用歷史，以山橿為主要原料生產(chǎn)的中成藥制劑“胃痛寧片”，臨床療效確切［3］。現(xiàn)有文獻(xiàn)研究表明，山橿主要含有黃酮類，生物堿類和揮發(fā)油類等成分［4］;本實驗室前期研究證明，以球松素為代表的黃酮類成分為主要有效部位之一［5］，并優(yōu)化了總黃酮部位的提取工藝。本實驗進(jìn)一步對山橿提取物中的總黃酮進(jìn)行了純化研究，實驗中考察了大孔吸附樹脂進(jìn)行純化的工藝參數(shù)，結(jié)果處理時綜合分析了收膏率，總黃酮收率和球松素收率3個指標(biāo)，用綜合得分進(jìn)行評價，最終確定的工藝能夠得到純度較高的山橿總黃酮，為山橿的進(jìn)一步開發(fā)研究提供了實驗依據(jù)。

1 材料、試劑與儀器

山橿藥材 (2010年采自于河南省新縣，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授鑒定為樟科Lauraceae山胡椒屬植物山橿Lindera reflexaHemsl.的根);球松素 (由本實驗室從山橿中分離得到，用HPLC法測定其純度達(dá)到99.05%)。

甲醇為色譜純 (天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司);其他試劑為分析純 (天津市化學(xué)試劑三廠);大孔吸附樹脂:HPD-450、HPD-600、D101(滄州寶恩吸附材料科技有限公司)，DM130、860021(山東魯抗立科藥物化學(xué)有限公司)，HP20(日本三菱化學(xué)株式會社)。

高效液相色譜儀LC-20AT(日本島津公司)，紫外檢測器SPD-20A(日本島津公司)，色譜工作站CBM-102(日本島津公司)，電子天平(BS224S，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1 對照品和樣品溶液的制備

對照品溶液的制備 精密稱取干燥的球松素標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇溶解分別配制成0.22 mg/mL，1.005 mg/mL的對照品溶液。

樣品溶液的制備 取山橿藥材粗粉適量，分別加入12倍量70%乙醇超聲提取3次，每次1.0 h，回收乙醇，濃縮;稱取浸膏，加甲醇超聲溶解，濾過，定溶，即得。

2.2 總黃酮的測定

2.2.1 檢測波長的考察 分別取適量對照品溶液和樣品溶液，在200～600 nm波長范圍掃描，對照品和樣品最大吸收波長都在286 nm處，確定286 nm作為總黃酮紫外檢測波長，見圖1。

圖1 200～600 nm紫外吸收光譜圖Fig.1 Ultraviolet absorption spectrum of 200-600 nm

2.2.2 線性關(guān)系考察 取質(zhì)量濃度0.22 mg/mL的對照品溶液，稀釋配制成質(zhì)量濃度2.20、4.40、8.80、11.00、13.20、17.60 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別連續(xù)3次測定吸光度，以對照品濃度為橫坐標(biāo)，平均吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明球松素質(zhì)量濃度在2.20～17.60 μg/mL之間線性關(guān)系良好，線性方程為Y=0.081X+0.008，r=0.999 4。

2.2.3 樣品中總黃酮的含量測定 按2.1項下樣品溶液制備方法，精密稱取0.1 g浸膏，甲醇超聲溶解并定容至50 mL，再精密吸取0.1 mL定容至10 mL，于286 nm測定吸光度，計算樣品溶液中的總黃酮量。

2.2.4 方法學(xué)考察 通過精密度，穩(wěn)定性，重復(fù)性的考察，表明該方法對總黃酮的測定穩(wěn)定、可行。

回收率考察 精密稱取適量的山橿藥材樣品6份，分別加入一定量的球松素標(biāo)準(zhǔn)品，按2.1項下方法制備樣品溶液，2.2.3項方法測定，計算平均回收率為99.78%，RSD為2.94%，表明該方法回收率良好。結(jié)果見表1。

2.3 球松素檢測方法

2.3.1 HPLC色譜條件 選擇phenomenex luna 5 μ C18色譜柱 (250 mm×4.60 mm)，檢測波長297 nm;柱溫為30℃;體積流量為1.0 mL/min;進(jìn)樣量為10 μL;流動相條件按表2梯度洗脫，能達(dá)到較好的分離效果，見圖2。

表1 回收率試驗結(jié)果Tab.1 Results of recovery tests

表2 梯度洗脫程序Tab.2 Gradient elution program

圖2 山橿HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of Lindera reflexa Hemsl.

2.3.2 線性關(guān)系考察 取1.005 mg/mL球松素標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別精密吸取2、5、10、15、20μL注入高效液相色譜儀，按2.3.1項HPLC條件測定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積均值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果表明，球松素進(jìn)樣量在2.01～20.10 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性方程為Y=2 896 600X+50 479，r=0.999 7。

2.3.3 樣品中球松素測定 按2.1項下樣品溶液制備方法，精密稱取0.1 g浸膏，甲醇超聲溶解，濾過，定容至50 mL，0.45 μm濾膜過濾;按2.3.1項HPLC條件進(jìn)行測定，計算樣品中球松素的量。

2.3.4 方法學(xué)考察 通過精密度，穩(wěn)定性，重復(fù)性的考察，表明該測定方法穩(wěn)定、可行。

回收率考察，精密稱取適量的山橿藥材樣品6份，分別加入一定量的球松素標(biāo)準(zhǔn)品，按2.1項下方法制備樣品溶液，按2.3.1項HPLC條件進(jìn)行測定，計算樣品中球松素的回收率。平均回收率為99.33%，RSD為2.69%，表明該方法回收率良好。結(jié)果見表3。

表3 回收率試驗結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests

2.4 綜合評價方法

為了把多個量綱不同的統(tǒng)計指標(biāo)，轉(zhuǎn)化成無量綱的相對評價值，并綜合這些評價值得出一個整體評價，本實驗選用了多指標(biāo)綜合評價方法。

運用多指標(biāo)綜合分析時，首先對各變量按相應(yīng)的方法作標(biāo)準(zhǔn)化變換，消除原變量量綱、數(shù)量級的不同帶來的影響［6］，本實驗選擇Z-score法對指標(biāo)進(jìn)行變換，公式如下:

經(jīng)過變換后的數(shù)據(jù)均值為0，方差為l。

數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，根據(jù)各指標(biāo)對結(jié)果的不同影響程度，采用主觀賦權(quán)法，對不同指標(biāo)分別賦予不同的權(quán)重系數(shù):球松素回收率權(quán)重系數(shù)0.4，收膏率和總黃酮回收率權(quán)重系數(shù)同為0.3，指數(shù)系數(shù)設(shè)定為100，計算綜合得分。

綜合評分公式為:

Y=(0.3×ZX1+0.3×ZX2+0.4×ZX3)×100，ZX為標(biāo)準(zhǔn)化的數(shù)據(jù)。

2.5 工藝條件考察

2.5.1 樹脂預(yù)處理 樹脂先用95%乙醇浸泡12 h后，濕法裝柱，用95%乙醇清洗至乙醇洗脫液與水混合 (1∶5)不呈白色混濁，蒸餾水洗至無醇味，備用。

2.5.2 大孔吸附樹脂型號的選擇 根據(jù)樹脂的極性、粒徑和孔徑等參數(shù)，選用經(jīng)過預(yù)處理的三個廠家的六個型號的樹脂，加入樣品液進(jìn)行靜態(tài)吸附考察，分別計算干膏的吸附率和解吸率，運用紫外分光光度法測定總黃酮的吸附率和解吸率，用HPLC法測定球松素的吸附率和解吸率，并綜合分析法計算綜合得分，比較綜合得分，DM130型適于山橿總黃酮的純化，結(jié)果見表4。

表4 不同型號樹脂吸附洗脫結(jié)果Tab.4 Results of different types of resin adsorption elution tests

2.5.3 上樣濃度的考察 S樣品液稀釋至質(zhì)量濃度為 0.02、0.033、0.05、0.1 g/mL，分別通過DM130樹脂上樣，洗脫，檢測，計算洗脫液收膏率，總黃酮回收率和球松素回收率。綜合評價結(jié)果，選取上樣質(zhì)量濃度為0.05 g/mL。結(jié)果見表5。

表5 不同上樣濃度測定結(jié)果Tab.5 Determination results of different concentrations of samples

2.5.4 上樣流速的考察 取質(zhì)量濃度0.05 g/mL樣品液，分別按0.5、1.0、1.5、2.0 mL/mim的體積流量進(jìn)行上樣，洗脫，檢測，計算洗脫液收膏率，總黃酮回收率和球松素回收率。綜合評價，選取上樣流速為1.0 mL/mim。結(jié)果見表6。

表6 不同上樣流速測定結(jié)果Tab.6 Measurement results of different samples flow velocity

2.5.5 上樣徑高比的考察 樣品液0.05 g/mL，體積流量1.0 mL/min，分別通過徑高比為1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的樹脂柱進(jìn)行上樣，洗脫，分別檢測，計算洗脫液收膏率，總黃酮回收率和球松素回收率。綜合評價，選取徑高比為1∶8。結(jié)果見表7。

2.5.6 樹脂最大上樣量的考察 取DM130型樹脂40 mL，樣品液0.05 g/mL按體積流量1.0 mL/min進(jìn)行上樣。分份收集流出液，每10 mL收集一份，共收集20份，薄層 (乙酸乙酯－石油醚=1∶5)展開后，噴三氯化鋁顯色，紫外熒光檢視球松素顯黃綠色熒光。第14管出現(xiàn)球松素斑點，說明從140 mL開始出現(xiàn)泄漏。

表7 不同徑高比考察結(jié)果Tab.7 Investigation results of different diameter ratio

最大上樣量的考察，取DM130型樹脂40 mL，按體積流量1.0 mL/min分別上樣品液 (0.05 g/mL)120、140、160、180 mL，吸附，洗脫，分別檢測，計算洗脫液收膏率，總黃酮回收率和球松素回收率。綜合評價，確定160 mL相當(dāng)于4倍樹脂量為最大上樣體積。結(jié)果見表8。

表8 最大上樣量考察結(jié)果Tab.8 Investigation results of maximum sample quantity

2.5.7 除雜用水量的考察 取40 mL完成上樣的DM130樹脂，分別加入80、120、160、200 mL純水除雜，洗脫，除雜效果直接影響產(chǎn)物的純度，分別檢測，計算洗脫液中總黃酮和球松素回收率和含量，結(jié)果見表9。

表9 不同體積水除雜考察結(jié)果Tab.9 Inspection results of different volumes of water impurity

洗脫用水量使總黃酮和球松素的含量增加，當(dāng)用洗脫水量超過160 mL(4倍樹脂量)時，總黃酮和球松素的回收率明顯降低，故選取4倍量為除雜用水量。

2.5.8 洗脫液濃度的確定 取完成上樣并除雜后的樹脂柱4根，分別用30%、50%、70%、95%乙醇洗脫，并檢測，計算洗脫液收膏率，總黃酮回收率和球松素回收率，綜合考慮評價結(jié)果和生產(chǎn)成本因素，選取70%乙醇作為洗脫液。結(jié)果見表10。

表10 不同洗脫液濃度考察結(jié)果Tab.10 Results of different elution concentrations

2.5.9 洗脫速率的考察 取已完成上樣的樹脂柱4根，按體積流量1.0 mL/min，4倍量純水除雜后，用70%乙醇按不同體積流量進(jìn)行洗脫，分別檢測，計算洗脫液收膏率，總黃酮回收率和球松素回收率。洗脫體積流量增大3個指標(biāo)變化不大，當(dāng)體積流量大于1.5 mL/min時各項3個回收率明顯減小，綜合考慮評價結(jié)果和時間因素，選取1.5 mL/min作為洗脫體積流量。結(jié)果見表11。

表11 不同洗脫速率考察結(jié)果Tab.11 Investigation results of different elution rates

2.5.10 洗脫液用量的考察 分別用不同量的70%乙醇洗脫，檢測，計算收膏率，總黃酮回收率和球松素回收率。當(dāng)洗脫液用量為160 mL時，總黃酮和球松素基本洗脫完全，選取洗脫液用量160 mL(4倍樹脂量)。結(jié)果見表12。

表12 不同洗脫乙醇量考察結(jié)果Tab.12 Investigation results of different elution volumes of alcohol

2.5.11 樹脂重復(fù)使用次數(shù)的考察 用確定上樣條件和洗脫條件，連續(xù)4次對同一根樹脂柱進(jìn)行重復(fù)上樣，洗脫。比較不同上樣次數(shù)的收膏率，總黃酮回收率和球松素回收率。結(jié)果第4次使用時吸附效率顯著降低，所以樹脂可重復(fù)上樣3次，需再生。結(jié)果見表13。

表13 樹脂重復(fù)試驗次數(shù)考察結(jié)果Tab.13 Investigation results of resin repeat test times

2.6 純化工藝條件驗證

按照以上確定的條件:DM130型樹脂，按徑高比1∶8裝柱，4倍量質(zhì)量濃度為0.05 g/mL樣品液，體積流量1.0 mL/min上樣，上樣完成后靜置2 h，以4倍量的純水除雜，4倍量的70%乙醇洗脫，進(jìn)行工藝驗證試驗 (n=3)，純化的總黃酮由27.1%達(dá)到50.0%以上，球松素的量由4.1%達(dá)到9.0%以上。結(jié)果見表14。

表14 純化工藝驗證Tab.14 Purification of process validation

3 討論

由于山橿黃酮類成分極性差異較大，所以首先選擇了滄州寶恩吸附材料科技有限公司、山東魯抗立科藥物化學(xué)有限公司、日本三菱化學(xué)株式會社3個廠家的11個型號的樹脂進(jìn)行了靜態(tài)吸附考察，從中優(yōu)選了效果較好的6個型號進(jìn)行動態(tài)吸附，最終確定了DM130樹脂吸附效果較好，能夠獲得純度較高的產(chǎn)物。

為了保證純化過程中主要成分不流失，本實驗選擇指標(biāo)性成分球松素、總黃酮和收膏率3個指標(biāo)對工藝進(jìn)行考核;參考相關(guān)文獻(xiàn) ［7］，同時用主要特征指紋峰面積的保留率評價山橿總黃酮精制效果，試驗結(jié)果證明11個主要成分峰全部保留，峰面積比例未改變，說明純化過程對總黃酮的主要成分組成保留效果較好。見圖3和圖4。

圖3 山橿HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatogram of Lindera reflexa Hemsl.

圖4 樹脂純化后樣品HPLC圖譜Fig.4 HPLC chromatogram of sample with resin purification

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