山沉香的質量控制研究

奧·烏力吉， 王青虎， 榮 君， 格根蘇布德， 曉 明

(內蒙古民族大學蒙醫(yī)藥學院，內蒙古通遼 028000)

山沉香為木犀科植物賀蘭山丁香Syringapinnatifolia flemslvar.alashanensisMaet S.Q.Zhou除去皮的干燥根和枝干，具有鎮(zhèn)“赫依”、清熱、止痛、平喘等功效，主治心“赫依”熱、氣喘、失眠、心跳、心絞痛等癥，主要分布于我國的內蒙古阿拉善盟賀蘭山水源涵養(yǎng)林保護區(qū)［1-2］。山沉香現(xiàn)已載入蒙醫(yī)藥相關書籍［3-4］，但除其蒙藥學和揮發(fā)油研究之外［5-11］，本品沒有“鑒別”和“定量測定”項，這對山沉香的質量、療效和安全有一定的影響。根據(jù)山沉香化學成分前期研究結果可知，山沉香主要成分有揮發(fā)油、香豆素及木脂素類化合物。為了該藥的正確使用和安全有效性，本實驗采用TLC法對不同來源的山沉香進行鑒別，同時運用HPLC法同時測定其中 3，3'-二甲氧基-4，4'，9，9'-四羥基簡單木脂素、3，4(3'，4')-二亞甲二氧基-9，9'-二羥基簡單木脂素、Syripinnalignan A、Syripinnalignan B、Syripinnalignan C的量，為綜合評價山沉香藥材的質量提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

KQ—100型超聲波清洗器 (昆山市超聲儀器有限公司);AUW200D型電子天平 (日本島津);高效液相色譜儀(LC10—Atvp輸液泵，SPD—M10Avp檢測器，SCL—10Avp工作站，DGU—12A脫氣機);UV—2501PC型分光光度計 (日本島津)。乙腈和甲醇為色譜純 (天津市光復精細化工研究所);水為超純水;三氯甲烷、無水甲醇、無水乙醇和磷酸等均為分析純;硅膠G(上海海洋化工廠);syripinnalignan B(S1)，syripinnalignin A(S2)，syripinnalignan C(S3)，3，3'-二甲氧基-4，4'，9，9'-四羥基簡單木脂素 (S4)，3，4(3'，4')-二亞甲二氧基-9，9'-二羥基簡單木脂素 (S5)均為自制［12］并用高效液相色譜儀分別測定其純度均高于99.0%，可作為對照品使用，結構式見圖1。藥材來源見表1。

表1 藥材來源

2TLC鑒別

2.1 供試液制備 稱取山沉香1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇20 mL，超聲處理30 min，搖勻，濾過。吸取濾液5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇至刻度，既得。

2.2 對照品貯備液的制備 分別精密稱取S1、S2、S3、S4、S5各10 mg，置于10 mL量瓶，加甲醇溶解并用甲醇稀釋至刻度，即得。

2.3 展開分析 分別吸取不同來源的樣品供試液和對照品溶液 (S1、S2)5 μL，點于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠板上，以三氯甲烷-丙酮 (10∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，用5%的香草醛硫酸乙醇溶液顯色，加熱使斑點清晰。結果見圖2。

3 山沉香的定量測定

3.1 提取溶劑選擇 稱取樣品 (A1)4份，每份1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，分別加三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇 (1∶1)、甲醇和75%甲醇20 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，再稱定其質量，分別用三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇 (1∶1)、甲醇和75%甲醇補足損失的質量，搖勻，濾過。分別吸取濾液10 mL，蒸干，加色譜甲醇溶解并定容至10 mL。在實驗所用的色譜條件下，測定色譜圖，結果見圖3和表2。

圖1 5種對照品的結構式

圖2 不同來源山沉香和S1、S2的TLC色譜圖

圖3 不同溶劑提取液HPLC色譜圖

根據(jù)圖3和表2的結果可知，除三氯甲烷提取液的色譜峰其余提取液色譜峰的吸收峰形狀、數(shù)目和位置基本一致，但甲醇中被檢測化合物的峰面積較高，故選擇甲醇作為提取溶劑。

表2 不同溶劑提取液中被檢測化合物的峰面積

3.2 檢測波長掃描 取山沉香樣品供試液 (A1)和對照品溶液適量，在200～400 nm范圍內進行掃描，結果見圖4。根據(jù)掃描結果選定281 nm為檢測波長。

圖4 樣品和5種對照品的UV掃描圖

3.3 色譜條件的選擇 大連依利特hypersil ODS2色譜柱 (300 mm×4.6 mm，5 μm);檢測波長281nm，流動相為甲醇-水溶液，梯度洗脫;體積流量1.0 mL/min，記錄色譜圖時間40 min;進樣量20 μL。在上述色譜條件下，syripinnalignan B(S1)，syripinnalignin A(S2)，syripinnalignan A(S3)，3，3'-二甲氧基-4，4'，9，9'-四羥基簡單木脂素 (S4)，3，4(3'，4')-二亞甲二氧基-9，9'-二羥基簡單木脂素 (S5)達到基線分離 (R＞1.5)，理論塔板數(shù)均不低于4 500。梯度洗脫程序見表3。

表3 梯度洗脫程序

3.4 方法學考察

3.4.1 標準曲線的繪畫 精密吸取S1、S2、S3、S4、S5對照品貯備液適量，分別用色譜甲醇配成不同質量濃度的系列對照品溶液，按上述色譜條件和方法分析測定，以對照品的質量濃度 (μg/mL)為橫坐標，對照品峰面積為縱坐標繪制標準曲線，計算其回歸方程式，結果見表4。分離色譜圖見圖5。

表4 線性關系考察

圖5 山沉香供試液和對照品溶液HPLC色譜圖

3.4.2 精密度試驗 S1，S2對照品貯備液適量，用色譜甲醇稀釋至20 μg/mL對照品溶液，S3、S4、S5對照品貯備液適量稀釋成6 μg/mL對照品溶液。在上述色譜條件下，進樣量20 μL，進樣6次，測得峰面積，計算S1，S2，S3，S4，S5的RSD值分別為1.02%、1.04%、1.98%、1.42%和1.56%。

3.4.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試液 (A1)20 μL，注入色譜儀，在24 h內每隔一定時間測定1次，進行穩(wěn)定性考察。在24 h內測定5次，數(shù)據(jù)穩(wěn)定。S1、S2、S3、S4、S5的RSD分別為1.18%、1.22%、2.01%、1.88%和1.74%。

3.4.4 重復性試驗 取供試品 (A1)6份，精密稱定，按上述色譜條件和定量測定項下進行測定，S1，S2，S3，S4，S5的 RSD分別為 1.19%、1.34%、1.89%、2.01%和1.81%。

3.4.5 加樣回收率試驗 稱取供試品 (A1)6份，每份0.05 g，精密稱定，按照表5分別精密加入S1，S2，S3，S4，S5，并按定量測定法進行測定，計算回收率，結果見表5。

表5 加樣回收試驗結果表(n=3)

3.4.6 定量測定 在上述色譜條件下，吸取不同來源山沉香供試液20 μL，注入色譜儀，按外標二點法計算質量分數(shù)。結果見表6。

表6 樣品測定結果 (n=5)

4 討論

本實驗選用的展開系統(tǒng)的專屬性、分離度和重復性較好，可作為山沉香定性鑒別的依據(jù)。

以三氯甲烷、三氯甲烷-甲醇 (1∶1)、甲醇和75%甲醇為溶劑進行了提取率的比較。結果S3在三氯甲烷中提取率高外，其余被檢測成分在甲醇中提取率均高于其他溶劑，故選用甲醇為提取溶劑。

色譜條件選擇中先用幾種甲醇和水的等梯度洗脫，色譜峰分離不好，所以選用了梯度洗脫。在實驗所用的梯度洗脫條件下，5種對照品與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5。

根據(jù)表6可知，不同來源山沉香中化合物S1和S2的相對含有量較高，但來源不同其相對含有量變化不大，其他成分也變化不大。這說明不同來源山沉香中化學成分基本一致。

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