HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定附子中5種水溶性成分

唐小龍， 黃志芳， 陳 燕， 劉玉紅， 劉云華， 趙軍寧， 易進(jìn)海*

(1.成都中醫(yī)藥大學(xué)，四川成都 610072;2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川成都 610041)

附子為毛莨科植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.子根的加工品，為有毒中藥的代表，具有回陽(yáng)救逆、補(bǔ)火助陽(yáng)、散寒止痛的功效［1］。附子中水溶性成分量微、不易檢測(cè)，其主要成分有去甲豬毛菜堿 (salsolinol)、去甲烏藥堿 (demethylcoclanrinhihenamine)、棍掌堿 (coryneine)、氯化甲基多巴胺 (coryneine chloride)、尿嘧啶 (uracil)等，均具有強(qiáng)心作用，其中，氯化甲基多巴胺和去甲豬毛菜堿還具有升壓作用［2－6］。但目前尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道附子水溶性成分的定量測(cè)定，本實(shí)驗(yàn)首次建立了HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定附子中鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、尿嘧啶、尿苷、鳥(niǎo)苷，該方法準(zhǔn)確、快速，為附子質(zhì)量控制提供新的參考方法。

1 儀器與試藥

Agilent 1200型高效液相色譜儀系列 (美國(guó)安捷倫科技公司，包括四元泵，DAD檢測(cè)器，柱溫箱，自動(dòng)進(jìn)樣器，工作站);KQ－100超聲波清洗儀 (昆山市超聲儀器有限公司);AUW220D型十萬(wàn)分之一電子天平 (日本島津);Sigma3K15高速冷凍離心機(jī) (德國(guó)Sigma);Millipore Milli-Q Integral 3超純水機(jī) (美國(guó)密理博)。甲醇為美國(guó)Fisher色譜純;水為超純水;其余試劑均為分析純。

對(duì)照品尿嘧啶 (批號(hào):100469-200401)、鹽酸多巴胺 (批號(hào):100070-200405)、尿苷 (批號(hào):887-200202)購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所;鳥(niǎo)苷(批號(hào):10111132)購(gòu)自上海同田生物技術(shù)有限公司;去甲豬毛菜堿對(duì)照品由本實(shí)驗(yàn)室從附子中分得，其純度為98.2%，經(jīng)理化性質(zhì)和光譜數(shù)據(jù)分析，鑒定其結(jié)構(gòu)。

生附子采自四川江油等地，其他實(shí)驗(yàn)樣品購(gòu)于成都荷花池藥材市場(chǎng)，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院舒光明研究員鑒定為毛莨科多年生草本植物烏頭Aconitum carmichaeliDebx.的子根。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Phenomenex Luna 5u PFP(2)100R色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);流動(dòng)相為0.1%磷酸-甲醇，梯度洗脫 (0～30 min，100∶0→87∶13);體積流量1.0 mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm(尿嘧啶，尿苷，鳥(niǎo)苷)和280 nm(鹽酸多巴胺，去甲豬毛菜堿);柱溫35℃;進(jìn)樣量10～50 μL;對(duì)照品溶液及供試品溶液的色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)照品 (A)和附子藥材 (B)HPLC圖Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances(A)and sample(B)

2.2 對(duì)照品溶液的制備 取尿嘧啶、鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、尿苷、鳥(niǎo)苷對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含尿嘧啶0.022 mg、鹽酸多巴胺0.026 mg、去甲豬毛菜堿 0.026 mg、尿苷0.055 mg、鳥(niǎo)苷0.037 mg的混合對(duì)照品溶液Ⅰ。精密吸取上述混合對(duì)照品溶液1 mL，加水溶液稀釋至10 mL，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液Ⅱ。

2.3 供試品溶液的制備 取附子粉末 (過(guò)三號(hào)篩)約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入0.05 mol/L鹽酸25 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用0.05 mol/L鹽酸補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，高速離心 (12 000 r/min)5 min，取上清液，即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系 精密吸取2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液Ⅰ5、10、15、20 μL和混合對(duì)照品溶液Ⅱ2、5、10、15、20 μL，注入液相色譜儀中，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得到尿嘧啶的回歸方程Y=5.13×103X+2.62，r=0.999 9;鹽酸多巴胺的回歸方程Y=8.58×102X－9.21，r=0.999 9;去甲豬毛菜堿的回歸方程Y=8.52×102X－9.07，r=0.999 9;尿苷的回歸方程Y=2.62×103X+4.24，r=0.999 9;鳥(niǎo)苷的回歸方程Y=2.68×103X+6.01，r=0.999 9。結(jié)果表明，尿嘧啶，鹽酸多巴胺，去甲豬毛菜堿，尿苷和鳥(niǎo)苷進(jìn)樣量分別在 0.004 4～0.44 μg，0.005 2 ～0.52 μg，0.005 2 ～ 0.52 μg，0.010 9 ～1.09 μg和0.007 3 ～0.73 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.2 檢測(cè)限與定量限 在選定的色譜條件下，當(dāng)信噪比為3時(shí)，測(cè)得尿嘧啶的檢測(cè)限為0.22 ng，鹽酸多巴胺的檢測(cè)限為2.35 ng;去甲豬毛菜堿的檢測(cè)限為2.63 ng，尿苷的檢測(cè)限為0.55 ng和鳥(niǎo)苷的檢測(cè)限為0.37 ng;當(dāng)信噪比為10時(shí)，測(cè)得尿嘧啶的定量限為0.71 ng，鹽酸多巴胺的定量限為5.73 ng;去甲豬毛菜堿的定量限為7.87 ng，尿苷的定量限為1.09 ng和鳥(niǎo)苷的定量限為1.46 ng。

2.4.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取供試品溶液 (S1)50 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，尿嘧啶，鹽酸多巴胺，去甲豬毛菜堿，尿苷和鳥(niǎo)苷的RSD分別 為 0.66%，0.91%，0.50%，0.53%， 和0.74%，表明儀器精密度好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取附子粉末 (S1)6份，按2.3項(xiàng)下制成供試品溶液，精密吸取供試品溶液各50 μL，注入液相色譜儀，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，記錄峰面積，計(jì)算。尿嘧啶的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為9.4×10－3mg/g(RSD=1.41%);鹽酸多巴胺的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 8.7×10－2mg/g(RSD=1.16%);去甲豬毛菜堿的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.3 mg/g(RSD=0.84%);尿苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.9×10－1mg/g(RSD=1.12%);鳥(niǎo)苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.7×10－1mg/g(RSD=0.95%)(n=6)。

2.4.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液 (S1)于0、1、2、4、8、24 h進(jìn)樣測(cè)定，尿嘧啶、鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、尿苷和鳥(niǎo)苷峰面積的RSD分別 為 0.93%、0.80%、0.70%、0.56% 和0.80%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.6 回收率試驗(yàn) 取已知含有量的附子粉末(S1)6份，精密稱取約0.5 g，分別精密加入一定量的尿嘧啶、鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、尿苷和鳥(niǎo)苷對(duì)照品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算加樣回收率。尿嘧啶的平均回收率為98.76%(RSD=1.86%);鹽酸多巴胺的平均回收率為102.59%(RSD=1.37%);去甲豬毛菜堿的平均回收率為101.68%(RSD=0.80%);尿苷的平均回收率為100.06%(RSD=0.51%);鳥(niǎo)苷的平均回收率為102.24%(RSD=0.78%)(n=6)。

2.4.7 樣品測(cè)定 取附子樣品，分別按2.3項(xiàng)下方法制成供試品溶液，依法測(cè)定，計(jì)算尿嘧啶、鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、尿苷、鳥(niǎo)苷的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 附子藥材測(cè)定結(jié)果Tab.1 Determination results of samples

3 討論

3.1 流動(dòng)相的選擇 參考文獻(xiàn)方法［7-10］，本實(shí)驗(yàn)經(jīng)進(jìn)一步優(yōu)化，最終確定流動(dòng)相為0.1%磷酸-甲醇，梯度洗脫，在此色譜條件下，樣品中尿嘧啶、鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、尿苷和鳥(niǎo)苷與其它色譜峰分離良好，且與對(duì)照品DAD光譜一致。本實(shí)驗(yàn)還比較了十八烷基硅烷鍵合硅膠柱 (Eclipse XDB C18，Phenomenex Luna C18)和五氟苯基柱(Phenomenex Luna PFP)，結(jié)果顯示五氟苯基柱分離效果更佳。

3.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 采用二極管陣列檢測(cè)器考察了尿嘧啶、鹽酸多巴胺、去甲豬毛菜堿、尿苷和鳥(niǎo)苷的DAD光譜，結(jié)果顯示:核苷類成分尿嘧啶、尿苷和鳥(niǎo)苷在260 nm有最大吸收，鹽酸多巴胺和去甲豬毛菜堿在280 nm有最大吸收，故分別選擇260 nm和280 nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3 提取方法的考察 本實(shí)驗(yàn)考察了水、酸水、30%甲醇、50%甲醇、30%甲醇 (含0.45%鹽酸)和50%甲醇 (含0.45%鹽酸)對(duì)提取效果的影響，結(jié)果表明以酸水提取效果最佳;對(duì)酸水濃度(0.025、0.05、0.1、0.2 mol/L)進(jìn)行了考察，表明對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)明顯影響，故本實(shí)驗(yàn)用0.05 mol/L鹽酸溶液提取。此外，還比較了回流與超聲對(duì)提取效果的影響，結(jié)果表明二者無(wú)明顯差異，故選擇簡(jiǎn)便的超聲提取。

3.4 結(jié)果分析 本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-DAD法同時(shí)測(cè)定附子中5種水溶性成分，方法簡(jiǎn)便可行。結(jié)果顯示，不同來(lái)源的生附子及炮制品中5種水溶性成分的量差異較大，從總體趨勢(shì)來(lái)看，生附子水溶性成分的含有量明顯高于炮制品，表明附子產(chǎn)地及其加工炮制對(duì)水溶性成分有顯著影響，炮制對(duì)附子水溶性成分損失嚴(yán)重，部分炮制品中水溶性成分已檢不出。附子水溶性成分具有顯著的強(qiáng)心和升壓作用，因此，有必要測(cè)定其代表性主要成分，才能更好地反應(yīng)、控制附子的質(zhì)量和有效性。本實(shí)驗(yàn)為附子炮制及其質(zhì)量控制提供了新的參考方法。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典:2010年版一部［S］.北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010:177.

［2］Kosuge T，Yokota M.Studies on cardiac principle aconite root［J］.Chem Pharm Bull，1976，24(1):176-178.

［3］姜文卿.附子1號(hào)對(duì)緩慢性心律失常的作用初步臨床觀察［J］.中華心血管病雜志，1980，8(2):95.

［4］Konno C，Shirasaka M，Hikino H.Cardioactive principle ofAconitum carmichaeliroots［J］.Planta Med，1979，35(2):150-155.

［5］陳迪華，李慧穎，宋維良.中藥附子成分研究Ⅱ.白附片的化學(xué)成分［J］.中草藥，1982，13(11):481.

［6］張衛(wèi)東，韓公羽.四川江油附子生物堿成分的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1992，27(9):670.

［7］吳艷瓊，梁潔雯.HPLC測(cè)定鹽酸多巴胺注射液的含量［J］.廣東藥學(xué)，2005，15(3):15.

［8］段晉燕，郭琳娜，張永謙，等.細(xì)胞中多巴胺及兒茶酚胺異喹啉類物質(zhì)的HPLC-MS/MS檢測(cè)［J］.化學(xué)通報(bào)，2010，73(11):1035.

［9］劉玉濤，滕顯偉.簡(jiǎn)述用HPLC法測(cè)定鹽酸多巴胺注射液有關(guān)物質(zhì)的方法［J］.黑龍江科技信息，2009(34):299.

［10］陳薛釵，王 睿，毛 健，等.Salsolinol合成酶的高效液相色譜－電化學(xué)活性檢測(cè)方法研究［J］.化學(xué)通報(bào)，2010，73(10):938.