醋莪術對氣滯血瘀證血液流變學影響的表征及譜效相關性研究

廖 婉， 章津銘， 傅 舒， 王繼森， 傅超美*

(1.成都中醫藥大學藥學院，中藥資源系統研究與開發利用省部共建國家重點實驗室培育基地，中藥材標準化教育部重點實驗室，四川成都 611137;2.成都市食品藥品檢測中心，四川成都 610045)

醋莪術為姜科植物蓬莪術Curcuma phaeocaulisVal.，廣西莪術Curcuma kwangsiensisS.G.Lee et C.F.Liang和溫郁金Curcuma wenyujinY.H.Chen et C.Ling的干燥根莖醋制而成［1］，具有破血行氣、消積止痛的功效。醋莪術入肝經血分，《本草綱目》云:“今人多以醋炒或煮熟入藥，取其引入血分也。” 《便讀》云: “嫌其峻厲，當以醋炒用之”。故臨床常用醋莪術，既增強“破積消堅，去積聚癖塊”之效，又緩其峻猛藥性。現有研究證明醋莪術具有抗腫瘤、抗病毒、抗氧化、保肝等藥理作用［2］，其揮發油、姜黃素為其主要物質基礎［3-4］。但大都忽略對醋莪術傳統功效及其物質基礎的整體性探索，不利于莪術炮制機理的揭示。

本實驗在建立了莪術醋制工藝［5］、醋莪術質量標準［6］和進行了指紋圖譜研究的基礎上，擬以大鼠血液流變學指標改善作用表征醋莪術“破血”功效，考察了10個批次醋莪術對“氣滯血瘀證”模型血液流變學的影響，并采用灰色關聯度分析方法，旨在將指紋圖譜所代表的化學信息與藥效數據代表的生物效應信息相關聯，通過譜效相關性研究尋找到醋莪術“破血”的有效物質基礎，為莪術的醋制機理和質量評價奠定基礎。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀 (Agilent 1200二極管陣列檢測器;四元泵在線脫氣系統;Agilent 1200色譜工作站)(美國安捷倫科技有限公司);Mettler AE240十萬分之一電子分析天平(德國Mettler公司);FA1104萬分之一電子分析天平 (上海天平儀器廠);KQ3200型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。MDK全自動血液流變測試分析儀 (型號:MDK—3200AR);全自動血細胞分析儀 (型號:MEK—6318K)。

1.2 試藥 鹽酸腎上腺素注射液 (廣州白云山制藥有限公司，批號:100503);復方丹參片 (中山市恒生藥業有限公司，生產批號:Z20103069)。

收集10個批次的生莪術飲片，經成都中醫藥大學標本中心盧先明教授鑒定為姜科植物蓬莪術Curcuma phaeocaulisVal.的干燥根莖，參照文獻［5］制備得醋莪術飲片。

醋莪術水煎液的制備:取醋莪術飲片200 g，加水15倍，煎煮2次，每次1 h，趁熱濾過，合并煎液，60℃減壓濃縮至2 g/mL，貯存于4℃備用。

莪術醇對照品 (成都曼思特生物科技有限公司，批號:A0089，純度≥98%);莪術二酮對照品 (四川省維克奇生物科技有限公司，批號:201007，純度≥98%);吉馬酮對照品 (成都曼思特生物科技有限公司，批號:A0320，純度≥98%);甲醇為色譜純，水為重蒸水 (自制)，其它試劑均為分析純。

1.3 實驗動物 清潔級KM小鼠，購自四川省醫學科學院實驗動物中心，動物合格證號:SCXK(川)2008-15，雌雄各半，體質量18～22 g。

2 方法與結果

2.1 醋莪術對“氣滯血瘀證”模型血液流變學的試驗研究

2.1.1 實驗方法［7］將大鼠隨機分6組 (樣本數為10)，即空白對照組 (等容積生理鹽水);模型對照組 (等容積生理鹽水);中藥陽性對照組 ［復方丹參片 (1.5 g/kg)］;醋莪術高劑量 (30 g/kg)、中劑量 (20 g/kg)、低劑量 (10 g/kg)組。藥效學實驗結果顯示醋莪術高劑量組 (30 g/kg)具有顯著性差異，故本實驗選用醋莪術高劑量組 (30 g/kg)進行驗證試驗，試驗方法如下:

除空白對照組外，各實驗組動物每日1次肌注氫化可的松10 mL/kg連續7 d，同時造模期間灌胃給予相應藥物1.5 mL/200 g，1次/d。第8天給予空白組外的實驗大鼠皮下注射1次0.1%鹽酸腎上腺素0.1 mL。造模后禁食，次日灌胃給藥后2 h自股動脈取血，滴入含肝素鈉抗凝試管 (實驗前每只試管加入1 mmol/L肝素生理鹽水溶液0.2 mL，60℃烘干備用)，以測定全血黏度等指標，另取20 μL抗凝全血備用以測血細胞壓積。

2.1.2 數據處理與統計 實驗數據采用±s(平均值±標準誤)表示，利用SPSS 13.0統計軟件處理，多組間比較采用One-way ANOVA檢驗。

2.1.3 實驗結果 結果顯示，試驗中10批醋莪術在全血黏度 (高切)、血漿黏度、紅細胞聚集指數、血沉、血細胞壓積等方面，對“氣滯血瘀”型大鼠模型有顯著改善 (P＜0.05)。見表1。

表1 不同批次醋莪術高劑量組 (30 g/kg)對大鼠血液流變學影響結果 (±s，n=10)Tab.1 Results of hemorheology influenced by the stir-baked Curcumae Rhizoma with vinegar(±s，n=10)

表1 不同批次醋莪術高劑量組 (30 g/kg)對大鼠血液流變學影響結果 (±s，n=10)Tab.1 Results of hemorheology influenced by the stir-baked Curcumae Rhizoma with vinegar(±s，n=10)

注:與模型對照組相比，*P＜0.05。

批號 全血黏度/(mPa·s)血漿黏度/(mPa·s)聚集指數 血沉/(mm·h－1) 血細胞壓積/%紅細胞空白對照組 4.21±0.08* 1.36±0.05* 9.21±0.08* 1.36±0.06* 38.9±0.17*模型對照組 6.13±0.15 1.69±0.08 10.79±0.07 7.48±0.06 58.41±0.21陽性對照組 4.65±0.11* 1.42±0.12* 9.68±0.06* 3.74±0.07 44.42±0.18*100503 4.63±0.14* 1.53±0.11* 9.79±0.12* 5.16±0.11* 36.63±0.23*100921 5.12±0.18* 1.52±0.03* 9.92±0.14* 5.18±0.14* 38.33±0.26*101106 5.37±0.21* 1.47±0.06* 9.88±0.12* 5.04±0.05* 35.85±0.35*101012 4.86±0.15* 1.62±0.05* 9.99±0.16 5.11±0.07* 35.53±0.27*100517 4.58±0.22* 1.45±0.08* 9.94±0.12* 5.03±0.07* 33.95±0.31*100825 4.73±0.15* 1.58±0.05* 10.12±0.17 5.09±0.13* 34.87±0.27*100921 4.85±0.23* 1.48±0.05* 10.25±0.24 5.14±0.15* 38.42±0.22*101121 4.58±0.12* 1.44±0.07* 9.95±0.27* 5.23±0.08* 36.85±0.31*100915 4.78±0.16* 1.42±0.06* 9.98±0.16* 5.19±0.06* 35.53±0.24*100714 4.66±0.15* 1.53±0.04* 10.03±0.22 5.12±0.09* 35.48±0.21*

2.2 醋莪術HPLC指紋圖譜數據測定

2.2.1 色譜條件 Agilent Zorbax C18色譜柱 (4.6 mm×250 mm，5 μm);DAD檢測器;檢測波長216 nm;色譜柱溫度35℃;體積流量1.0 mL/min;運行時間100 min;流動相為乙腈 (A)-水 (B)，梯度洗脫 (0～15 min，40% ～45%A;15～40 min，45% ～55%A;40～60 min，55% ～60%A;60～80 min，60% ～80%A;80～90 min，80% ～95%A)。

2.2.2 指紋圖譜檢測 醋莪術混合對照品及共有模式HPLC指紋圖譜見圖1、圖2。根據所建立的醋莪術指紋圖譜共有模式，確定了10批次醋莪術共形成了16個共有峰，將10個批次醋莪術飲片相應保留時間的色譜峰面積進行整理，見表2。

圖1 混合對照品的HPLC指紋圖譜Fig.1 HPLC fingerprinting of reference substances

圖2 醋莪術HPLC指紋圖譜共有模式Fig.2 HPLC fingerprinting of common pattern of the stir-baked Curcumae Rhizoma with vinegar

2.3 醋莪術“譜-效”模型的建立 由于中藥指紋圖譜信息具有灰色性和模糊性，灰色關聯度是分析系統中各因素關聯程度的一種方法，是兩個系統或兩個因素間關聯性大小的量度，其基本思想是一種相對性的排序分析，是根據序列曲線幾何形狀的相似程度來判別其是否緊密。如果一組幾何曲線形狀越相似，則關聯度就越大，反之越小［8］。因此，本研究采用灰色關聯度分析法［9］，以樣品藥效學指標作為母序列，樣品指紋圖譜色譜峰信息作為子序列，依據母序列與子序列關聯度大小，可確定諸指紋特征對藥效貢獻的大小，由此從所考察的復雜系統中找出主次因素。

2.3.1 關聯系數 經數據變換的母序列記為 {Xo(k)}，子序列記為 {Xi(k)}，則母序列與子序列的關聯系數Loi(k)可由下式計算，關聯系數反映了兩個被比較序列的靠近程度:

其中，Δoi(k)=∣Xo(k) －Xi(k)∣ (1≤i≤m);Δmin和Δmax分別表示所有比較序列絕對差中的最小值和最大值;ρ為分辨系數，即是為了削弱最大絕對差數值太大引起的失真，提高關聯系數之間的差異顯著性，一般為0～1之間，本研究取為0.8。

表2 10批次醋莪術16個HPLC共有峰的峰面積數據Tab.2 Results of 16 common peaks of fingerprint of the stir-baked Curcumae Rhizomd with vinegar

2.3.2 關聯度計算 關聯度按兩比較序列的關聯系數的均值計算。公式如下:

roi為子序列i與母序列o的關聯度，N為比較序列的數據個數。

2.3.3 排關聯序 將m個子序列對同一母序列的關聯度按大小順序排列起來，便組成關聯序，記為{X}，它直接反映各個子序列對母序列的“貢獻”的大小。據此可尋找指紋特征峰對應的化學成分與藥效間的聯系。

2.3.4 譜效相關性分析 見表3～表7。

表3 醋莪術指紋圖譜共有峰與全血黏度關聯結果Tab.3 Results of correlation of whole blood viscosity and common peaks of fingerprint of the stir-baked Curcumae Rhizoma with vinegar

關聯結果表明，對于抗全血黏度作用，醋莪術中成分與之關聯度較大的前5個自變量，依次是色譜峰X6＞X9＞X11＞X12＞X13。

關聯結果表明，對于抗血漿黏度作用，醋莪術中成分與之關聯度較大的前5個自變量，依次是色譜峰X11＞X6＞X7＞X10＞X9。

表4 醋莪術指紋圖譜共有峰與血漿黏度關聯結果Tab.4 Results of correlation of blood plasma viscosity and common peaks of fingerprint of the stir-baked Curcumae Rhizoma with vinegar

表5 醋莪術指紋圖譜共有峰與血細胞聚集指數關聯結果Tab.5 Results of correlation of blood cell aggregation index numbers and common peaks of fingerprint of the stir-baked Curcumae Rhizoma with vinegar

表6 醋莪術指紋圖譜共有峰與血細胞沉降關聯結果Tab.6 Results of correlation of blood cell sedimentation and common peaks of fingerprint of the stir-baked Curcumae Rhlzoma with vinegar

關聯結果表明，對于抗血細胞聚集作用，醋莪術中成分與之關聯度較大的前5個自變量，依次是色譜峰X6＞X11＞X9＞X10＞X12。

關聯結果表明，對于抗血細胞沉降作用，醋莪術中成分與之關聯度較大的前5個自變量，依次是色譜峰X6＞X7＞X11＞X9＞X10。

表7 醋莪術指紋圖譜共有峰與紅細胞壓積關聯結果Tab.7 Results of correlation of VPRC and common peaks of fingerprint of the stir-baked Curcumae Rhlzoma with vinegar

關聯結果表明，對于紅細胞壓積作用，醋莪術中成分與之關聯度較大的前5個自變量，依次是色譜峰X6＞X9＞X7＞X10＞X11。

通過將10個批次醋莪術的16個共有色譜峰與其血液流變學5個藥效指標相關聯 (表中只列出前5個貢獻最大的色譜峰)發現，與醋莪術不同血液流變學指標貢獻作用關聯度較大的色譜峰群不同，第6號、7號、9號、10號、11號、12號、13號色譜峰與醋莪術對氣滯血瘀證大鼠血液流變學的藥效作用相關性貢獻較大。因此，可判斷出這7個色譜峰為體現醋莪術破血作用的生物信息峰簇，但具體所反映的物質成分，還需進一步的探索研究。

3 討論

中醫辨證施治用的是藥味而并非是單個化學成分，中藥指標成分的控制，難以真正反映和評價中藥藥效。中藥的“行氣、活血、化瘀”等傳統功效，是藥材飲片或成藥制劑內含有效物質的整體作用結果，包括其所含的物質數、物質量和組成比例，不能只針對幾個化學成分，必須對物質群整體予以控制。盡管中藥指紋圖譜方法采用多指標比對的方法控制中藥質量，被認為完整性地控制了中藥的物質群體，但單純的化學指紋圖譜還不能很準確地評價中藥的成分與其藥效之間存在的相關信息。

近年來，研究者［10］逐漸認識到中藥質量評價中指標性成分選擇的重要性，指標成分選擇的單一性和專屬性差是目前中藥質量控制的關鍵問題。因此，建立譜－效模型，將藥效學信息與化學指紋圖譜信息進行相關性研究，尋找與藥效相關的指紋峰或成分群，有利于中藥活性物質基礎的篩選和中藥質量有效性控制，是尋找中藥活性成分一種新思路。

目前構建譜效模型采用的數據分析方法還不統一規范［11-12］，主要有相關分析、聚類分析、回歸分析、灰色關聯度分析、圖譜比對法等多種方法，各種方法各有優點和不足，采用何種方法或多種方法組合使用來研究譜效關系仍需要進一步研究和探討。本研究在試驗過程中，曾采用SPSS 13.0的多元回歸分析對16個共有峰信息和5個藥效指標進行相關聯，但采用多元回歸分析的強迫引入法時，由于將分析的所有變量一次性全部引入進行分析，因同時引入的變量較多，使各因素的影響變小，掩蓋了主要因素的作用，使其不能通過顯著性檢驗，從而難以保證兩者關聯的準確性;而采用逐步回歸法時，按各因素的貢獻由大到小依次引入，每引入一個變量，就對其進行顯著性分析，但無法同時分析各因素的作用，因此，本試驗最終選擇了源自灰色系統理論的灰關聯分析法進行“譜-效”的相關分析，同時基于灰色系統理論中的灰關聯聚類法進行譜效模型的建立將有利于構建一種新的模式識別模型。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫藥科技出版社，2010.

［2］朱善嵐，黃品芳，王友芳，等.莪術的藥理作用研究進展［J］.海峽藥學，2007，19(4):9-10.

［3］陸兔林.中藥莪術有效物質及飲片規范化研究［D］.南京:南京中醫藥大學，2003.

［4］呂狄亞.中藥莪術化學成分分析及藥代動力學研究［D］.上海:第二軍醫大學，2011.

［5］廖 婉，傅 舒，劉 芳，等.星點設計-效應面法優選蓬莪術醋制工藝［J］.中藥與臨床，2011，2(6):22-24.

［6］廖 婉，傅超美，章津銘，等.醋莪術飲片質量控制方法的研究［J］.華西藥學雜志，2012，4(8):402-404.

［7］任建勛，林成仁，王 敏，等.多因素整合建立氣滯血瘀證動物模型研究［J］.中藥藥理與臨床，2007，2(5):210-211.

［8］朱詩塔，雷 鵬，李新中，等.掌葉大黃不同炮制品指紋圖譜與其止血作用的灰色關聯度分析［J］.中南藥學，2009，7(1):55.

［9］宋琳莉.基于不同來源黃芩物質基礎拮抗流感病毒的實驗研究［D］.北京:北京中醫藥大學，2009.

［10］李云飛，程翼宇，范驍輝.中藥多維譜效關系研究思路探討［J］.中國天然藥物，2010，8(3):167-170.

［11］鄧書鴻，聶 磊.中藥譜效關系的分析方法及數據處理技術研究進展［J］.中藥材，2010，33(11):1819-1823.

［12］范驍輝，葉正良，程翼宇.基于信息融合的中藥多元色譜指紋圖譜相似性計算方法［J］.高等學校化學學報，2006，27(1):26-29.