腦必通膠囊對局灶性腦缺血大鼠腦血流量及內皮細胞iNOS表達的影響

秦媛媛， 楊 磊， 張慧靈， 沈夕坤

(1.蘇州中醫醫院，江蘇 蘇州 215009;2.蘇州大學藥理學教研室，腦血管病藥理研究室，江蘇 蘇州 215123)

腦中風是一組以腦部缺血及出血性損傷癥狀為主要臨床表現的疾病，又稱腦卒中或腦血管意外，主要分為出血性腦中風 (腦出血或蛛網膜下腔出血)和缺血性腦中風(腦梗死、腦血栓形成)兩大類，以腦梗死最為常見。目前中醫對于缺血性腦中風常用活血化瘀、益氣活血等藥物進行治療［1］。腦必通膠囊是由紅景天、三七、川芎和銀杏葉四味中藥組成的復方制劑，每種成分從天然植物的提取物精制而成，有助于促進血氣循環、活腦寧神。本實驗室前期工作已證明腦必通膠囊對大鼠永久性大腦中動脈阻塞所致的腦中風具有保護作用 (待發表)。但腦必通膠囊對腦血流量及其血管內皮細胞是否有影響，尚未見文獻報道。本實驗探討腦必通膠囊對局灶性腦缺血大鼠腦血流量的影響及其誘導內皮細胞誘導型一氧化氮合酶 (iNOS)表達的機制。

1 材料

1.1 實驗動物及細胞 SD大鼠，雄性，體質量280～310 g，清潔級。由蘇州大學醫學院實驗動物中心提供［生產許可證 XCYK(蘇):2002－2008)，使用許可證 SYXK(蘇):2002－0037］。人臍靜脈內皮細胞 (HUVEC)由ScienCell研究室提供。

1.2 藥物及試劑 腦必通膠囊，香港保健協會提供，批號為3GB081001。實驗前用0.5% 羧甲基纖維素鈉 (CMC)配制。紅四氮唑 (TTC)，由國藥生產，批號:RA1881;水合氯醛，五聯化工廠 (中國上海)，批號:w20021122;多聚甲醛，天津市化學試劑研究所產品，批號:20020308，iNOS兔多克隆抗體，武漢博士德公司產品。

1.3 儀器 電子天平 (AL104 Mettler-Toledo公司)。動物腦立體定位儀;激光多普勒血流儀 (ML191 ADInstruments公司);缺氧培養氣室 (MIC-101，Billups-Rothenberg);電泳儀 (power PAC 2000，Biorad公司);X光自動洗片機(X-OMAT2000，美國KODAK公司);離心機 (5810R，德國Eppendorf公司);基因擴增儀 (MyCycler Thermal Cycler，美國BIORAD公司)。

2 方法

2.1 分組和給藥 取60只SD雄性大鼠，體質量 (280±20)g，蘇州大學醫學院實驗動物中心提供。隨機分成6組，每組10只。(1)對照組:每天灌以0.5%CMC，假手術后24 h處死。(2)模型組:缺血24 h后處死。(3)腦必通大劑量組:按350 mg/(kg·d)劑量灌胃;腦必通中劑量組:按175 mg/(kg·d)劑量灌胃;腦必通小劑量組:按87.5 mg/(kg·d)劑量灌胃。(4)復方丹參滴丸陽性對照組:按67.5 mg/(kg·d)灌胃。各組均以1 mL/100 g體積灌服，連續7 d，末次給藥2 h后進行手術，用于實驗。

2.2 對永久性大腦中動脈阻塞 (pMCAO)模型大鼠腦血流量的影響 將麻醉大鼠頭部固定于腦立體定位儀上，沿顱骨正中偏右切開皮膚及皮下組織，在大鼠前囟后1.5 mm，中線右側旁開5 mm處鉆一個直徑1 mm的小孔，該點為大腦中動脈缺血中心區［2］。沿小孔插光纖探頭到大腦皮層表面，用血流儀配套的固定器固定光纖探頭，監測腦中動脈缺血 (MCAO)前的基礎值 (手術前)、MCAO后腦血流值 (手術后)，穩定5 min后開始記錄數據。

2.3 含藥血清的制備 SD大鼠隨機分成4組，每組3只，即 (1)正常對照組;(2)腦必通膠囊0.44 g/kg組 (小劑量);(3)腦必通膠囊0.88 g/kg組 (中劑量);(4)腦必通膠囊1.76 g/kg組 (大劑量)。

每組按1 mL/100 g灌胃，每天2次，連續3 d，第4天灌藥后1 h，乙醚麻醉，腹主動脈取血，3 000 r/min離心10 min，取血清，經56℃ 30 min滅活后，過濾滅菌，－80 ℃保存備用［3］。

2.4 氧糖剝奪模型的建立 先將培養HUVEC細胞的培養液換成無糖DMEM培養基，然后轉移置缺氧培養氣室中，同時打開有白色塑料鉗夾的聚丙烯管道的進氣口和出氣口，將入口處的聚丙烯管道于包含有所需的混合氣體的源頭相連，向氣室內充入95%的N2和5%的CO2氣體，將氣流自動控制在每分鐘20 L，大約4 min氣室被完全充滿后，切斷氣體來源，關上白色的塑料鉗夾以緊閉氣室，最后將這個氣室置于37℃溫育。氧糖剝奪的時間分別是1、3、6、12、24 h。

2.5 Real-Time PCR HUVEC細胞經氧糖剝奪處理后，利用TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA量。本實驗采用的引物由寶生物工程 (大連)有限公司設計，上海皓嘉生物科技有限公司合成。引物序列如下:

HUVEC細胞經氧糖剝奪處理后3 h，收集置離心管，1 200 r/min離心5 min。棄上清并將其轉移至EP管中，加入1 mL trizol室溫靜置5 min，12 000 r/min 4℃離心5 min。小心吸取上清液，移入新的離心管中 (切勿吸取沉淀)。小心吸取上清液，向EP管中加入三氯甲烷 (RNAiso Reagent的1/5體積量)，蓋緊離心管蓋，用力震蕩。待充分乳化溶液呈乳白狀后，室溫靜置5 min。從離心機中小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，即無色的上清液、中間的白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相。吸取上清液轉移至另一新的離心管中。向上清中加入等體積的異丙醇，上下顛倒離心管充分混勻后，在15～30℃下靜置 10 min，離心。

2.6 Western Blotting HUVEC細胞經氧糖剝奪處理后，用超聲波細胞破碎儀在冰浴下超聲裂解細胞，－80℃ 保存備用。取1 μL蛋白質溶液，用BCA蛋白定量試劑盒測定以上所提取的蛋白濃度，調整上樣量，使各組蛋白總量一致，按次序上樣，安排已知分子量的標準物，電泳結束后，用蛋白轉移裝置將蛋白轉到硝酸纖維素膜上，按轉移蛋白的常規方法進行。

轉移終了，凝膠進行蛋白染色液染色、脫色液脫色，以確定膠中蛋白質的轉移情況。膜用TBST漂洗后。轉移結束后，以TBST洗膜，室溫搖動。將硝酸纖維素膜加入封閉液中置常溫搖動。封閉結束后，將硝酸纖維素膜放入一塑料袋中，按每平方厘米膜加0.1 mL一抗溶液 (iNOS稀釋度為1∶500，5%脫脂牛奶溶于TBST中)，混勻后裝入袋中，去除帶內所有氣泡，用封膜機封上開口，4℃過夜。棄去反應液，TBST洗3次，每次10 min。在膜上加入二抗:IgG-HRP溶液 (1∶5 000，5%脫脂牛奶溶于 TBST中)，室溫下輕輕振蕩1 h取出膜，在PBS中洗膜3次，每次10 min。ECl顯色，壓片。

2.7 免疫熒光法 HUVEC細胞經氧糖剝奪處理后，用PBS洗滌3次;每孔加入1%BSA，室溫下避光搖1 h;每組相應各孔加入相應蛋白的第一抗體iNOS(1∶400)，室溫下振搖1 h，4℃孵育過夜;用PBS漂洗3次，加第二抗體，室溫下振搖1 h，PBS漂洗3次，貼片，封片，熒光顯微鏡和共聚焦顯微鏡下觀察，攝片。

3 結果

3.1 對pMCAO大鼠局部相對腦血流量的影響 假手術組大鼠腦血流量無明顯改變。腦必通膠囊 175 mg/kg、350 mg/kg給藥7 d后顯著增加大鼠的基礎局部相對腦血流量(rCBF)(圖A1～A6，1B)。模型組rCBF降低至術前的9.79%，腦必通膠囊 87.5 mg/kg、175 mg/kg、350 mg/kg組rCBF分別降低至術前的13.35%、14.73%、16.66%，與模型組相比，腦必通膠囊中、大劑量組具有顯著性差異(圖1A，圖1C;P＜0.05，P＜0.01)。腦必通小劑量組pMCAO后與模型組比較亦有增高趨勢，但未達到統計學上的顯著水平 (圖1A1～A6，圖1C)，提示腦必通膠囊可以增加大鼠基礎及pMCAO后腦血流量。見圖1。

3.2 HUVEC細胞氧糖剝奪后iNOS mRNA表達時程變化及腦必通膠囊含藥血清對iNOS mRNA的表達影響 Real-Time PCR結果顯示:對照組HUVEC細胞iNOS mRNA表達較少，HUVEC細胞氧糖剝奪3 h，iNOS mRNA表達顯著增加(P＜0.01)，氧糖剝奪6 h、12 h、24 h iNOS mRNA表達較對照仍有較高表達 (P＜0.05)。結果見圖2A。

為了證明腦必通膠囊含藥血清能否上調HUVEC細胞氧糖剝奪后iNOS mRNA的表達，采用Real-Time PCR觀察腦必通膠囊含藥血清對HUVEC細胞氧糖剝奪后iNOS mRNA表達的影響。結果證明:對照組HUVEC細胞iNOS mRNA表達較少，HUVEC細胞氧糖剝奪3 h iNOS mRNA表達較對照顯著上調 (P＜0.05，P＜0.01)，腦必通膠囊含藥血清大、中劑量組iNOS mRNA的表達較模型組顯著上調(P＜0.01)。結果提示:腦必通膠囊含藥血清可上調HU-VEC細胞氧糖剝奪后iNOS mRNA的表達。結果見圖2B。

圖1 相對腦血流量的變化

3.3 HUVEC細胞氧糖剝奪后iNOS蛋白表達的時程變化以及腦必通膠囊含藥血清對iNOS蛋白表達的影響 Western blotting結果顯示:對照組HUVEC細胞iNOS的蛋白量較低，氧糖剝奪處理組iNOS的蛋白量顯著增加 (P＜0.01)，氧糖剝奪3 h、6 h、12 h組與對照組比較有顯著性差異 (P＜0.01)，其中氧糖剝奪12 h組，iNOS的蛋白量到達高峰，氧糖剝奪24 h組iNOS蛋白量下降至接近于對照組水平。結果見圖3A，3C。

Western blotting結果同樣顯示:對照組HUVEC細胞iNOS的蛋白量較低;氧糖剝奪3 h、6 h、12 h組iNOS的蛋白量顯著增加 (P＜0.01);其中氧糖剝奪12 h組iNOS的蛋白量最高，腦必通膠囊含藥血清中、大劑量組可顯著增加iNOS的蛋白量 (P＜0.01)，并呈現較好的劑量依賴性。提示腦必通膠囊含藥血清可增加HUVEC細胞氧糖剝奪后的iNOS蛋白量。結果見圖3B，3D。

免疫熒光結果顯示:對照組HUVEC細胞iNOS的表達量少，熒光極弱，主要分布在細胞漿;氧糖剝奪1 h組iNOS胞漿表達明顯增強，核內可見少量熒光;氧糖剝奪3 h組iNOS胞漿內熒光強度增加，部分細胞胞核內可見較多熒光顆粒，氧糖剝奪6 h、12 h組，細胞漿內熒光更強，細胞核內可見大量熒光顆粒，以氧糖剝奪12 h組表達最強;氧糖剝奪24 h后熒光變弱，彌散在細胞內，但仍可見細胞核內有熒光顆粒。結果見圖4A。

圖3 HUVEC細胞氧糖剝奪后iNOS蛋白水平的表達以及腦必通膠囊對iNOS蛋白表達的影響

圖4 HUVEC細胞氧糖剝奪后iNOS的表達以及腦必通膠囊對iNOS表達的影響

免疫熒光結果顯示:對照組HUVEC細胞iNOS的表達量少，熒光極弱，主要分布在細胞漿;氧糖剝奪12 h組，細胞核內可見大量熒光顆粒，細胞漿內熒光強度顯著增加，腦必通膠囊含藥血清大、中劑量組可顯著增加細胞內iNOS的熒光強度，大劑量組熒光顆粒增多明顯 (P＜0.01，P＜0.05)。提示腦必通膠囊含藥血清可增強HUVEC細胞氧糖剝奪后所致的iNOS的表達。結果見圖4B。

4 討論

腦必通膠囊是用天然植物川芎、銀杏葉等提取物精制而成，其總黃酮量達26.7%，有助于促進血氣循環、活腦寧神。雖然對中藥防治腦缺血的研究較多，但目前關于腦必通膠囊對局灶性腦缺血大鼠腦血流量的影響及其誘導內皮細胞iNOS的表達的機制，尚未見文獻報道。

當腦血流降低到代謝物質的運輸不足以滿足代謝的需要時，即發生腦缺血損傷。腦缺血的中心問題是氧和能量的耗竭，因此及早增加腦組織氧和血液的供應量是防治缺血性腦損傷的關鍵。應盡早改善并維持缺血組織局部有效的供血，改善腦微循環障礙，減輕神經元損傷［4］。激光多普勒血流測量 (LDF)可以無損傷性的快速反饋血流量的變化信息，可以連續、實時加監測神經組織微循環血流量，其測量范圍小，可以精確的動態反映局部組織的微循環的血流動力學［5］。本實驗運用大鼠pMCAO模型研究了腦必通膠囊對腦缺血的影響，發現預先給藥350、175、87.5 mg/kg 1周，可顯著增加基礎及腦缺血后缺血局部腦血流量。腦必通膠囊的組成成分紅景天、三七、川芎和銀杏葉具有改善血液流變學指標及抑制血小板聚集的作用，這些作用可能是腦必通膠囊增加腦血流量的機制之一。但腦必通膠囊對內皮細胞是否有直接作用?

NO是目前公認的一種信息傳遞分子，在腦缺血損傷中具有神經保護和神經毒性雙重作用［6］:即在腦缺血早期表現出保護作用，但NO濃度持續性增高可導致DNA和線粒體的功能損害，后期表現為神經毒性作用［7］。腦缺血早期產生的NO可通過激活鳥苷酸環化酶使cGMP水平升高，擴張腦血管，從而增加缺血區腦血流，保護腦組織［6］。由于NO化學性質活潑，不易準確定量測定，其生物作用又完全依賴于NOS的活性，因而其合成酶一氧化氮合成酶(NOS)成為近年缺血性腦血管疾病研究的熱點。根據組織來源不同，NOS可分為神經元細胞型 (nNOS)、內皮細胞型 (eNOS)、誘導型 (iNOS)。誘導型NOS(iNOS)［6］，廣泛存在于小膠質細胞、星形膠質細胞、中性細胞、巨噬細胞等多種細胞中。iNOS是一種非Ca2+依賴性的酶，在生理情況下，iNOS并不表達，但在病理情況下，一些細胞可誘導基因轉錄，啟動蛋白質合成，生成iNOS，故誘導數小時后才顯示酶活力，且由于iNOS受DNA轉錄調節，一經誘導，長時間保持酶活力。iNOS基因表達調控區有低氧誘導因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)的結合位點，HIF-1是缺氧調節iNOS基因表達所必需的［2］，血管內皮細胞缺氧時iNOS基因表達增加［2］。

本實驗應用低糖結合物理性缺氧誘導氧糖剝奪所致內皮細胞損傷模型可模擬腦缺血損傷的具體過程［9］。本實驗結果表明:HUVEC細胞氧糖剝奪后早期觀察到iNOS mRNA的上調;亦觀察了HUVEC細胞氧糖剝奪后，iNOS蛋白的激活及核轉位的變化。HUVEC細胞氧糖剝奪后iNOS蛋白量即開始有所增加，并隨氧糖剝奪時間推移而逐漸增強，于12 h達高峰，24 h有所下降［2］。本實驗觀察了預先給予腦必通膠囊含藥血清，HUVEC細胞氧糖剝奪后iNOS的表達變化。實驗結果表明，腦必通膠囊含藥血清可顯著上調iNOS mRNA表達;增加HUVEC細胞氧糖剝奪后iNOS的蛋白水平［2，11］。結果提示腦必通膠囊增加大鼠局部腦血流量可能與其增加內皮細胞iNOS的表達，從而擴張腦血管有關［11］。

本課題組最近的實驗結果表明 (待發表):腦必通膠囊對腦缺血的保護作用與其激活內皮細胞HIF-1信號通路有關［12］。大量研究表明低氧環境下引起HIF-1α的表達，HIF-1α與其靶基因中的低氧反應元件 (HRE)結合，介導缺氧反應，并產生明顯的細胞保護作用［13］，從而調節血管舒縮反應，增加缺血區腦血流，改善局部血液供應，使缺氧的組織細胞保持氧穩定，減輕缺血性腦損傷，發揮明顯的腦保護作用［13］。iNOS 是HIF-1α 的主要靶基因之一［3，14］，因此推測腦必通膠囊可能通過激活內皮細胞HIF-1α，從而增加內皮細胞iNOS的表達。

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