鱟試驗測定注射用頭孢雷特中細菌內毒素的方法學研究

吳帆 金釗 黃明

（1.四川省達州市通川中醫院，四川 達州 635000；2.成都中醫藥大學，四川 成都 610097；3.四川省食品藥品檢驗所，四川 成都 610097）

細菌內毒素檢查是藥品一個非常重要的安全指標，輸液導致熱原超標是輸液反應的主要原因［1］，近年來，世界各國越來越多地以細菌內毒素檢查法代替家兔熱原法檢查藥品和生物制品的致熱物質越來越普遍。注射用頭孢雷特臨床適應于革蘭氏陰性菌引起的肌骨感染、呼吸道感染、尿道感染及心內膜炎等。《中國藥典》2010年版尚未收載該品種。為此，特對注射用頭孢雷特進行了細菌內毒素的檢查。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑

注射用頭孢雷特（四川抗菌素工業研究所1.0g，批號：090911，090912，090913），細菌內毒素工作標準品（中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-200860，160EU·支-1）；細菌內毒素檢查用水（湛江安度斯生物有限公司，批號：0911060）；鱟試劑（湛江安度斯生物制品有限公司，λ=0.5EU· ml-1，批號：0909042），鱟試劑（湛江博康海洋生物有限公司，λ=0.5EU·ml-1，批號：0912210）

1.2 方法

1.2.1 鱟試劑靈敏度（λ）的復核

按照《中國藥典》［2］附錄規定的方法，對實驗所用的鱟試劑（TAL）進行靈敏度復核。結果鱟試劑的實測靈敏度均在0.5～2.0λ之間，符合規定。正式實驗時取λ作為鱟試劑的靈敏度。

1.2.2 樣品細菌內毒素限值（L）的確定

參照《中國藥典》確定樣品的細菌內毒素限值（L），L=K·M-1，K 為人用每千克體重每小時最大可接受的細菌內毒素劑量，非放射性藥品靜脈途徑給藥時 K 值為5EU·（kg·h-1），M 為人用每千克體重每小時給藥最大劑量。注射用頭孢雷特成人最大劑量2000 mg·（kg-1·h-1）。綜合生產、臨床用藥和檢驗的實際情況，將注射用頭孢雷特的L值定為0.5EU·mg-1。

1.2.3 樣品的干擾試驗

用λ=0.5EU·ml-1鱟試劑進行干擾試驗時，取1.2.1項下鱟試劑，分別對1批已檢測細菌內毒素不超標的樣品進行4、2和1 mg·ml-1濃度（批號：09011），進行細菌內毒素干擾試驗。樣品在表1 所述3 種濃度下，對細菌內毒素檢查均無干擾，故正式實驗將樣品稀釋為4mg·ml-1和2mg·ml-1，并取2個廠家靈敏度為0.5EU·ml-1的鱟試劑，參照有關文獻［3］按靈敏度復核方法對樣品稀釋為4mg·ml-1和2mg·ml-1濃度進行干擾實驗，并計算以樣品稀釋液配制的細菌內毒素溶液反應終點濃度的幾何均值（Et）及細菌內毒素檢查用水配制的內毒素溶液反應終點濃度的幾何均值（Es）。

1.2.4 樣品中細菌內毒素的常規檢查

取上述3批注射用頭孢雷特稀釋為2mg·ml-1的濃度，以λ=0.5EU·ml-1的鱟試劑，按常規凝膠法進行細菌內毒素檢查。

2 結果

注射用頭孢雷特稀釋為4mg·ml-1和2mg·ml-1濃度進行干擾試驗時，其Et與相應的Es均在0.5～2.0之間，且Es在0.5～2.0λ之間，表明此時樣品在4mg·ml-1和2mg·ml-1濃度對細菌內毒素檢查均無干擾，見表2。上述3批注射用頭孢雷特中的細菌內毒素含量均小于0.25EU·mg-1，見表3。

表1 樣品的干擾預試驗（EU·ml－1）

3 討論

凝膠法系通過鱟試劑與內毒素產生凝集反應的原理來檢測［4］，要求在適宜的溫度、pH 值及無干擾作用時鱟試劑能與微量的細菌內毒素反應形成凝膠，通過肉眼觀察結果。在建立新藥的細菌內毒素檢查法時，首先要確定其細菌內毒素限值，還要求至少取3批樣品，并應用2個廠家的鱟試劑進行細菌內毒素的干擾試驗，確認樣品在某一濃度下不會干擾細菌內毒素檢查［2］，本品根據注射用頭孢雷特最大臨床的規定劑量，確定其細菌內毒素限值為內毒素應小于0.25EU·mg-1，并應用2個廠家鱟試劑對3批注射用頭孢雷特樣品進行了細菌內毒素檢查的干擾試驗，結果當樣品濃度為2mg·ml-1，對鱟試驗檢查無干擾作用。從而證實可以建立該品種的細菌內毒素檢查法，其細菌內毒素限值應小于0.25EU·mg-1。

表2 樣品的干擾試驗（EU·ml－1）

表3 樣品中細菌內毒素的常規檢查

1 孫佩芳，王春江，王建民，等.5年輸液反應送檢結果分析［J］.中國醫院藥學雜志，2002，22（2）：122-123.

2 中華人民共和國國家藥典委員會.中國藥典［S］，二部.北京：化學工業出版社，2010，附錄99-102.

3 肖貴南，李瑾翡，吳招娣.鱟試驗測定乙酰谷酰胺氯化鈉注射液中的細菌內毒素［J］.華西藥學雜志，2006，21（40）：390-391.

4 劉華，徐曉霞，別小琳.鱟試驗測定復方氨基酸（15）雙肽（2）注射液中的細菌內毒素［J］.四川生理科學雜志，2007，29（1）：39-40.