HPLC 法同時測定忍冬的花、葉中木犀草苷和綠原酸含量

時新剛 ，舒希凱，2 ，劉偉 ，劉峰 ，李圣波 ，王曉，王岱杰*

(1.山東省分析測試中心，山東 濟南 250014;2.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟南250014;3.山東亞特生態(tài)技術(shù)有限公司，山東 臨沂 266071)

金銀花為忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾或待初開的花，是我國傳統(tǒng)中藥及保鍵飲品的常用大宗原料，具有清熱解毒、抗菌消炎、保肝利膽等功能［1］。現(xiàn)代藥理研究表明，金銀花中主要成分為綠原酸、異綠原酸等酚酸類物質(zhì)以及木犀草苷等黃酮類物質(zhì)［2-3］，藥典［1］中將木犀草苷和綠原酸作為金銀花的指標成分。

長期以來忍冬花蕾和初花作為主要利用部位大量入藥，并作為提取綠原酸、木犀草苷等物質(zhì)的工業(yè)原料［4-6］。而忍冬葉是生產(chǎn)金銀花的副產(chǎn)品，雖然產(chǎn)量較高，約為花的5 倍，卻一直被視為非藥用部位而長期未得到有效利用。有研究表明，忍冬葉中所含的藥理活性物質(zhì)與花相近或高于花［7］，其提取物具有較為廣泛的抗微生物作用［8］，極具開發(fā)價值。本文通過測定比較3 種具有代表性的忍冬的花和葉中木犀草苷和綠原酸的含量，為忍冬葉的進一步綜合利用提供實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1120 高效液相色譜儀(美國Agilent 公司);KT-300Y 超聲波藥品處理機;AE240 電子分析天平(Mettler 公司)。

乙腈為色譜純，甲酸為分析純，均購自山東禹王試劑公司;水為高純水。木犀草苷和綠原酸對照品自制，純度均大于98%;藥材為亞特、意大利、九豐一號的花、葉，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)李佳副教授鑒定為忍冬科植物忍冬Lonicera japonica Thunb.的花蕾和葉。

1.2 色譜條件方法

Shim-pack-ODS 色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流動相A=0.2 %的甲酸水，流動相B=乙腈;檢測波長350 nm;柱溫25℃;進樣量10 μL;梯度洗脫:0～15 min(10 %～20 %B)，15～30 min(20 % B)。

1.3 標樣和樣品溶液的制備

標樣溶液的制備:精密稱取木犀草苷對照品適量，配制成濃度分別為0.005、0.01、0.05、0.1、0.3 mg·mL-1的對照品溶液;精密稱取綠原酸對照品適量，配制成濃度分別為0.1，0.25，0.5，1.25，2.5 mg·mL-1的對照品溶液。

樣品溶液的制備:精密稱取過4 號篩金銀花藥材粉末0.3 g，置錐形瓶中，加入70 %甲醇100 mL，稱定;超聲提取20 min，稱重;分別用70%甲醇補足重量，搖勻，過濾，濃縮并定容至25 mL 作為樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 線性關(guān)系

分別吸取木犀草苷和綠原酸對照品溶液10 μL 進樣。以對照品標準溶液濃度為橫坐標(X)，其峰面積為縱坐標(Y)線性回歸，木犀草苷的回歸方程為Y=6 ×108X +461735，R=0.9998，綠原酸的回歸方程為Y=6 ×108X+ 4 × 106，R=0.9997。結(jié) 果 表 明，木 犀 草 苷 在0.005～0.3 mg · mL-1，綠 原 酸 在0.1～2.5 mg·mL-1呈良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度實驗

取同一批次亞特忍冬花樣品溶液，連續(xù)進樣6 次，木犀草苷和綠原酸的RSD 分別為0.35 %、0.27 %，精密度良好。

2.3 穩(wěn)定性實驗

取同一批次亞特忍冬花樣品溶液，分別于0、3、6、9、12、18、24 h 進行測定，結(jié)果木犀草苷和綠原酸的RSD 分別為0.52 %、0.41 %，結(jié)果表明，樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性實驗

取同一批次亞特忍冬花樣品6 份，每份0.1 g，精密稱定，按1.3 樣品溶液的制備方法制備。木犀草苷和綠原酸的RSD 分別為0.84 %、0.65 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.5 加樣回收率實驗

取同一批次亞特忍冬葉樣品6 份，每份0.15 g，精密稱定，分別加入與樣品相當量的綠原酸對照品溶液(2.5 mg·mL-1)2.0 mL 和木犀草苷對照品溶液(0.3 mg·mL-1)3.0 mL，按1.3 樣品溶液制備方法制備，并按1.2 色譜條件進行測定，分別計算木犀草苷和綠原酸的加樣回收率，結(jié)果見表1，2。

表1 木犀草苷的加樣回收率實驗結(jié)果(n=6)Table 1 Recovery rate of luteoloside (n=6)

表2 綠原酸的加樣回收率實驗結(jié)果(n=6)Table 2 Recovery rate of chlorogenic acid (n=6)

2.6 樣品含量的測定

對照品及樣品HPLC 色譜圖見圖1。由圖可見，在該分析條件下，木犀草苷、綠原酸色譜峰與其它組分分離效果良好。取不同品種的忍冬花和葉的干燥粉末約0.3 g，精密稱定，按1.3 樣品制備方法制備，按1.2 色譜條件注入液相色譜儀，測定峰面積，計算木犀草苷和綠原酸的含量，見表3。

表3 樣品測定結(jié)果Table 3 Determination results of three kinds of Lonicera japonica Thunb.

圖1 混合對照品及樣品的HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of mixed reference substances and samples

3 結(jié)論

本文通過比較3 種具有代表性的忍冬的花、葉中木犀草苷和綠原酸的含量，發(fā)現(xiàn)葉中木犀草苷含量遠遠高于花，尤其在亞特品種中差別達12.7 倍。綠原酸是金銀花中的主要活性成分之一，具有消炎、抗菌等作用［9］。木犀草苷具有多種生理活性，對缺血缺氧培養(yǎng)的乳鼠的心肌細胞有保護作用［10］，對K562 細胞增殖也具有抑制作用［11］，是一種潛在的抗癌藥物。因此，忍冬葉是一種開發(fā)木犀草苷等黃酮類化合物的優(yōu)質(zhì)原料。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典［M］.北京:化學(xué)工業(yè)出版社，2010:205 -206.

［2］LEE E J，KIM J S，KIM H P，et al.Phenolic constituents from the flower buds of Lonicera japonica and their 5 -lipoxygenase inhibitory activities［J］.Food Chemistry，2010，120(1):134 -139.

［3］朱丹，袁芳，孟坤，等.黃酮類化合物的研究進展［J］.中華中醫(yī)藥志，2007，22(6):387 -389.

［4］RAHMAN A，KANG S C.In vitro control of food -borne and food spoilage bacteria by essential oil and ethanol extracts of Lonicera japonica Thunb［J］.Food Chemistry，2009，116(3):670 -675.

［5］THANABHORN S，JAIJOY K，THAMAREE S，et al.Acute and subacute toxicity study of the ethanol extract from Lonicera japonica Thunb［J］.Journal of Ethnopharmacology，2006，107(3):370 -373.

［6］HAVESTEEN B.F1avonoids，a class of natural products of highpharm acological potency［J］.Biochemical Pharmacology，1983，32(7):114l-1148.

［7］武雪芬，李玉賢，魏煒.金銀花越冬老葉有效成分測定［J］.中藥材，1997，20(1):607.

［8］趙彥杰.金銀花葉提取物的抑菌效果研究［J］.食品科學(xué)，2007，28(7):63 -65.

［9］林云良，孫慶雷，祝賀，等.超聲波法提取金銀花中綠原酸工藝參數(shù)優(yōu)化研究［J］.山東科學(xué)，2008，21(1):25 -27.

［10］周玲，解硯英，李杰，等.木犀草素-7-O-β-D-葡萄糖苷對缺血缺氧培養(yǎng)的乳鼠的心肌細胞有保護作用［J］.中藥新藥與臨床藥理，2008(4):259 -261.

［11］韓寧寧，葉文博.木犀草素和木犀草苷對K562 細胞增殖的影響［J］.上海師范大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2008，37(6):622 -626.