重組免疫毒素GnRH-PTD-PE39KDEL 的構建及表達

扈進冬 ，魏艷麗 ，楊合同，2* ，李紀順，張廣志

(1.山東省科學院生物技術研究中心，山東省應用微生物重點實驗室，山東 濟南 250014;2.山東理工大學生命科學學院，山東 淄博 255049)

免疫毒素是由具有催化作用的毒素和有適當導向作用的細胞因子、短肽激素或者抗體構建的具有藥理活性的生物制劑，既具有特異性的識別功能，又具有毒素的殺傷功能，主要應用于腫瘤的導向治療。研究表明，免疫毒素在細胞培養水平有很好的選擇性結合與殺傷腫瘤細胞的作用［1］。但目前在應用中，由于實體瘤的結構問題，不存在對靶組織的特異性殺傷作用較弱，尤其對大型實體瘤的浸潤性較差，在體內的免疫反應嚴重等問題，所以如何增強靶向毒性蛋白中PE 部分的細胞毒性，研制出只殺死病理相關細胞的免疫毒素就成為關鍵［2-3］。蛋白質轉導域(protein transduction domain，PTD)可以有效地將蛋白、多肽及核酸片段通過無受體介導、無耗能的方式，導入多種哺乳動物細胞，且在一定濃度范圍內不會造成細胞損傷。PTD 是蛋白靶向入胞有力的生物學手段，為親水性大分子藥物跨越細胞生物膜、血腦屏障［4-5］以及治療疾病提供了新的途徑，在細胞生物學、基因治療、藥物體內轉運、臨床藥效評價及細胞免疫學等研究領域均具有良好的應用前景［6］。而通過在免疫毒素中引入PTD 可以增強免疫毒素對腫瘤細胞的穿透性，增強其對實體瘤的浸潤性，從而提高對實體瘤的殺傷作用［7］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質粒和菌株

大腸桿菌DH5α，BL21(DE3)plysS 為本實驗室保存菌種，人乳腺癌MCF-7 細胞為本室保存。質粒pETTrx/GnRH-PE39KDEL，本室構建，其中克隆有GnRH-PE39KDEL 基因，pET-His 表達載體購自美國基因動力實驗室有限公司深圳代表處，引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

1.1.2 試劑

Taq DNA 聚合酶、限制性核酸內切酶、T4DNA 連接酶及其配套緩沖溶液、DL2000 DNA Marker 均購自Takara 公司。IPTG、DNA Marker、瓊脂糖、蛋白質中等分子量marker、氨芐青霉素購自生工生物工程(上海)有限公司。凝膠電泳回收試劑盒購自天根公司，凝血因子Xa 購自德國Merck 公司，HiTrap Benzamidine FF購自通用電氣醫療集團，其他為國產分析純試劑。MTT 和RPMI 1640 培養液購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司。

1.2 方法

1.2.1 GnRH-PTD-PE39KDEL 基因的獲得

設計3 條引物:MiddlePTDF1 5＇TACAACGCTGGTCGTCGTGCTCGTCGTCGTCGTCG TCGTCACTTCCCGGA AGGTGG;MiddlePTDF2 5＇ CGGGATCCGTGGAAGGTCGCGAACACTGGTCTTACGGTCTGCGTCCGGGTTACAACG CTGGTCGTCG;GnRHR 5＇ CGGAATTCTCACAGTTCGTCTTTCGG。其中在MiddlePTDF1 中引入PTD 核酸序列，MiddlePTDF2 中引入Factor Xa 蛋白酶切割位點(斜體部分)，MiddlePTDF2 和GnRHR 中分別引入BamH I和EcoR I 酶切位點(下劃線標注)，然后采用兩輪PCR 從質粒pET-Trx/GnRH-PE39KDEL 中擴增獲得GnRHPTD-PE39KDEL。PCR 反應體系為:10 ×Taq DNA buffer 5 μL，上下游引物20 μmol/L，dNTP 100 μmol/L，模板DNA 0.1 μg，Taq DNA 聚合酶3U，ddH2O 補足到50 μL。反應條件為:94℃預變性2 min;94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，30 個循環;72℃延伸10 min。采用DNA 純化試劑盒進行目的DNA片段的純化。

1.2.2 GnRH-PTD-PE39KDEL 基因重組質粒的構建

提取質粒pET-His，用BamH I 和EcoR I 雙酶切，回收2.8 kb 的線性質粒;PCR 擴增過的GnRH-PTDPE39KDEL 基因片段同樣用BamH I 和EcoR I 雙酶切，回收酶切產物片段，使用T4 DNA 連接酶進行連接，于16℃連接過夜，連接產物為pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL 重組質粒。直接轉化E.coli DH5α 感受態細胞，涂布LB+Amp 平板，37℃倒置過夜培養。使用MiddlePTDF2 和GnRHR 為引物進行菌落PCR 初步鑒定轉化子，并進行限制性內酶酶切重組質粒和測序鑒定(生工生物工程(上海)有限公司)。

1.2.3 GnRH-PTD-PE39KDEL 融合蛋白的表達篩選

取上述1.2.2 中構建的pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL 質粒1 μL，稀釋10 倍后直接轉化E.coli 表達菌株BL21(DE3)plysS 感受態細胞，在轉化平板上挑取轉化子若干，2 mL LB +Amp(胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，用NaOH 調節pH 值到7.0，含100 μg/mL Ampicillin)液體培養基37℃振蕩過夜培養。次日，取20 μL 過夜培養液加入到2 mL YTA +Amp(胰蛋白胨16 g/L，酵母提取物10 g/L，氯化鈉10 g/L，用NaOH 調節pH 值到7.0，含100 μg/mL Ampicillin)液體培養基中轉培養，37℃振蕩培養3 h，至OD600 在0.5～0.7 之間，然后加入IPTG 至終濃度為0.3 mmol/L，30℃振蕩培養誘導表達3～8 h。誘導前，隨機從一個樣品中取出0.5 mL 菌液，電泳檢測時作為誘導對照。誘導表達完后，各取0.5 mL 菌液(視表達細菌的量多少而變化，一般在0.2～0.5 mL 之間)，5 000 r/min 離心5 min 收集細胞，包括未誘導的樣品，重懸于100 μL 去離子水中，以此為電泳樣品作質量分數為12.5%的SDS-PGAE。根據電泳結果，得到有表達的菌株。

1.2.4 GnRH-PTD-PE39KDEL 融合蛋白的大規模表達

挑取篩選獲得的表達菌株單克隆在LB +Amp 液體培養基中37℃過夜振蕩培養，次日，按照體積比1:100加入到100 mL YTA+Amp 培養基中轉培養，37℃振蕩培養3 h 后，加入IPTG 至終濃度為0.3 mmol/L，再30℃振蕩誘導培養6 h。誘導培養完后，菌液5 000 r/min 離心10 min 收集細胞，細胞重懸于5 mL 預冷的1 ×PBS，加入50 μL 體積分數20%的Triton X-100，充分混勻后冰浴30 min，進行超聲波破碎細胞。超聲循環為:超聲1 s;間隔1 s;全程40 s。重復4 次，每次間隙時將菌液在冰浴中混勻，避免局部溫度太高，使蛋白質變性。最后，將破碎后的菌液10 000 r/min 離心15 min，收集上清液和沉淀，上清液和沉淀分別留樣、備用。

1.2.5 GnRH-PTD-PE39KDEL 融合蛋白初純品的制備

將破碎上清液加到Ni-NTA 層析柱中，流速控制在0.3 mL/min 左右，收集穿透部分，用于SDS/PAGE 分析蛋白質的結合情況。然后用5 倍Ni-NTA 體積的NTA-0 Buffer 洗，流速控制在0.5 mL/min，用NTA-10 Buffer (20 mmol Tris-HCl pH=7.9，0.5 mol NaCl，10% Glycerol，20 mmol Imidazole)洗5 倍Ni-NTA 體積，流速控制在0.5 mL/min 左右，去除未結合雜蛋白。最后用NTA-500 Buffer (20 mmol Tris-HCl pH=7.9，0.5 mol NaCl，10% Glycerol，500 mmol Imidazole)洗脫，直到檢測不到蛋白為止，流速控制在0.3 mL/min左右。取上述經過Ni-NTA 樹脂純化的融合蛋白溶液，使用Factor Xa 切割緩沖液(20 mmol Tris-HCl，100 mmol NaCl，2 mmol CaCl2，(pH=8.0))調整至10 mL，用Minipore Ultra-4 超濾離心管濃縮至0.5 mL，加入10 μg的Factor Xa，23℃溫育16 h，裂解液SDS-PAGE 電泳檢測。然后使用HisTrap FF 和HiTrap Benzamidine FF分別去除未切割的重組蛋白和Factor Xa，得到純度達到90%以上的藥物原液，并使用HPLC 對純化樣品進行測定。

1.2.6 GnRH-PTD-PE39KDEL 的細胞毒性實驗

取人乳腺癌MCF-7 細胞進行消化和收集，將細胞用RPMI 1640 培養液稀釋成5 ×104個/mL 的細胞懸液，接種于96 孔板，100 μL/孔，37℃培養4 h。對照加入100 μL 培養液。樣品先用RPMI 1640 培養液稀釋成100 μL/mL，作為起始孔，然后按每孔與上孔2 倍的關系稀釋樣品，各加入稀釋的樣品每孔100 μL，每個梯度設8 個平行孔，實驗設陰性對照(加等體積的細胞懸液)和空白對照(只含培養基)。體積分數為5%CO2培養箱，37℃培養24 h，取出，用MTT 法染色，用酶標儀570 nm 進行測定并計算IC50值。

2 結果與討論

2.1 GnRH-PTD-PE39KDEL 重組質粒的鑒定

使用MiddlePTDF2 和GnRHR 為引物進行菌落PCR 擴增初步鑒定，瓊脂糖電泳結果顯示有約1.2 kb 的特異目的條帶(見圖1)，提取重組GnRH-PTD-PE39KDEL 重組質粒。使用BamHI、EcoRI 進行雙酶切，獲得2個片段，2.8 Kb 和1.2 Kb，與預期長度相符(見圖2)，經測序后確認序列完全正確。

2.2 pET-His-GnRH-PTD-PE39KDEL 表達產物的鑒定

總蛋白經SDS-PAGE 電泳顯示在約45 kD 處有一條目的產物條帶，與預期基本一致，采用圖像分析軟件Bandscan 5.0 分析，表明表達量占總蛋白的20%左右，誘導表達培養產物經超聲波破碎，分離上清液和沉淀，用SDS-PAGE 電泳。結果表明，GnRH-PTD-PE39KDEL 以可溶性形式表達(圖3)。

2.3 免疫毒素蛋白純化品的制備

破碎上清液Ni-NTA 鎳親和層析柱純化后得到純化免疫毒素蛋白，Minipore Ultra-4 超濾離心管濃縮至0.5 mL(濃度約1 mg/mL)，加入10 μg 的Factor Xa，23℃溫育16 h，并使用HiTrap Benzamidine FF(high sub)去除Factor Xa，最終獲得免疫毒素蛋白初純品，SDS-PAGE 電泳顯示明顯的單一條帶(圖4)。經HPLC 對純化樣品進行測定，主要吸收峰面積超過90%。

2.4 免疫毒素蛋白對人乳腺癌MCF-7 細胞的毒性

檢測結果(見表1)表明，GnRH-PTD-PE39KDEL 和對照GnRH -PE39KDEL 對人乳腺癌MCF-7 細胞均有較強的細胞毒性，隨著劑量的增加，其對細胞活性的抑制率也有所增強，至5.0 μg/mL 后，其抑制率增幅變緩。GnRH-PTD-PE39KDEL 和對照GnRH-PE39KDEL 對人乳腺癌MCF-7 細胞的IC50分別為0.860 μg/mL 和1.018 μg/mL，靶向融合蛋白引入PTD 后對人乳腺癌MCF-7 細胞的毒性表明較GnRH-PE39KDEL 增強。

表1 不同濃度GnRH-PTD-PE39KDEL 和GnRH -PE39KDEL對MCF-7 細胞的抑制作用Table 1 Inhibitory effects of GnRH-PTD-PE39KDEL and GnRH -PE39KDEL of different concentrations on cell MCF-7

3 結論

PE 是銅綠假單胞桿菌分泌的一種毒性非常強烈的外毒素，是免疫毒素構建中常用的毒素分子，PE 由3個功能區構成，各區功能明確［8］。PE39KDEL 是綠膿桿菌外毒素A(PE)的截短形式(在去除I 區的PE 毒素的基礎上再缺失359～365 位氨基酸后，PE 毒素的活性會大幅度提高［9］;同時，將PE 末端5 個氨基酸REDLK 突變為KDEL 后，PE 的活性也會大幅度提高即為PE39KDEL)。免疫毒素的導向部分具有識別靶細胞特異性受體的功能，常見的導向部分有c-Met，即原癌基因met 編碼的酪氨酸激酶受體［10］;F3 肽，即來自高遷移組蛋白(high mobility group protein，HMG)N2 的31 個氨基酸片段［11］;EGF(表皮生長因子)［12］;GnRH(又稱作LHRH 促黃體激素釋放激素)或其衍生物等。其中GnRH 或其衍生物為導向部分，PE 為毒素部分的靶向治療劑已經有廣泛的報道［13-14］，這些融合蛋白的靶向性已得到廣泛驗證［15］，能特異性地識別目的細胞并將其殺死［16-17］，但在實際應用中對于動物模型中生長旺盛的實體瘤起效不大，本文我們選用一種PTD，其氨基酸為YNAGRRARRRRRR，能夠有效地介導外源物質進入細胞的胞質當中，有介導能力強、速度快、溫度適應性廣、濃度依賴性小、能夠摻入所有細胞等特點。PTD 與其他蛋白的融合表達產物能高效地進入體外培養的細胞內，并且表現出生物學活性。胞質轉導肽融合分子可以穿越細胞膜而不損傷細胞［18］，被胞質轉導肽帶入細胞的分子仍保留其原有的性質［19］。PTD 介導無活性的分子進入細胞后仍能重新折疊，自我復性，是基因工程藥物經濟、高效利用的一種有效途徑。將PTD 定位于融合蛋白GnRH 的C 端和PE39KDEL的N 端之間，預期將可以大大提高免疫毒素穿透細胞生物膜的能力，增強對實體瘤的浸潤性，從而減少免疫毒素融合蛋白的使用量，降低副作用，其效果是其它方法所無法比擬的。

此外，我們在此融合蛋白的N 端引入了6 個His 標簽和Factor Xa 蛋白酶切位點，表達后的產物是含有6個His 標簽和GnRH-PTD-PE39KDEL 的前體融合蛋白，Factor Xa 蛋白酶切割純化的重組蛋白N 端無任何來自載體的氨基酸，直接得到GnRH-PTD-PE39KDEL，從而使生產、純化工藝簡化，為融合蛋白GnRH-PTDPE39KDEL 的大規模純化和功能研究奠定了基礎。

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