水牛乳抗氧化活性肽制備中蛋白酶的選擇

文 / 李 玲 曾慶坤* 農(nóng)皓如 唐 艷 林 波

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院廣西水牛研究所）

活性肽具有蛋白質(zhì)及氨基酸不可比擬的功能活性，較蛋白質(zhì)抗原性低，不易出現(xiàn)過(guò)敏現(xiàn)象，耐酸、耐熱、溶解性好，風(fēng)味比游離氨基酸更易接受，且吸收機(jī)制優(yōu)于蛋白質(zhì)及游離氨基酸[1]。目前發(fā)達(dá)國(guó)家，尤其是歐美以及日本，乳源肽功能食品市場(chǎng)已經(jīng)形成較大規(guī)模，乳源肽嬰幼兒食品、乳源肽抗過(guò)敏食品、乳源肽功能飲料等產(chǎn)品受到消費(fèi)者的青睞。本文通過(guò)對(duì)水牛乳活性肽制備過(guò)程中的蛋白酶進(jìn)行篩選，為水牛乳蛋白酶解工藝的優(yōu)化以及水牛乳活性肽的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

水牛乳：采自廣西水牛研究所種畜場(chǎng)；堿性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、動(dòng)物復(fù)合蛋白酶、植物復(fù)合蛋白酶：南寧龐博生物技術(shù)有限公司；Protamex蛋白酶：諾維信公司；DPPH：Sigma公司；其余試劑為分析純。

乳成分分析儀：FOSS，丹麥；pH計(jì)：Orion Research，美國(guó)；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：江蘇省金壇市金南儀器制造有限公司；紫外分光光度計(jì)：Perkin Elmer，美國(guó)； Alpha 1-2 LD真空冷凍干燥機(jī)：Christ，德國(guó)。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶酶活力的測(cè)定

參照GB/T 23527—2009。

1.2.2 水解度的計(jì)算

采用pH-Stat[2]滴定法。根據(jù)多肽在不同的pH值的條件下解離狀態(tài)不同：當(dāng)pH值恒定時(shí)，酶解蛋白后形成的自由羧基、自由氨基或氨基酸殘基數(shù)目不等；當(dāng)堿性條件下水解時(shí)，釋放的氨基酸使溶液pH值明顯下降，用稀堿液將其滴定回起始pH值，可知蛋白質(zhì)的肽鍵斷裂情況，根據(jù)消耗堿的量計(jì)算水解度DH值。

水解度=（水解的肽鍵數(shù)/總肽鍵數(shù)）×100%

計(jì)算公式：

公式中：VNaOH：滴定消耗的堿體積（mL）；

NNaOH：滴定消耗的堿當(dāng)量濃度（mol/L）；

Mp：參加蛋白水解的蛋白質(zhì)總量（g）；

Htot：每克蛋白質(zhì)中肽鍵的克當(dāng)量數(shù)（酪蛋白為8.2 mmol/g）；

α：α-氨基酸的平均解離度。

α的計(jì)算公式為：α=10pH-pK/（1+10pH-pK，pK=7.8+2 400×（298-T）/298T，T=273.15+t，t為反應(yīng)環(huán)境的溫度（℃），pH為反應(yīng)起始pH值。

1.2.3 DPPH清除率的計(jì)算

參考Saiga A[3，4]等人的方法，配置0.1 mmol/L的DPPH無(wú)水乙醇溶液，測(cè)定加樣方法見(jiàn)表1。充分震蕩混勻后，室溫下反應(yīng)30 min，在517 nm下測(cè)定吸光度值。清除率的計(jì)算公式如下：

1.2.4 酶解工藝

水牛乳→乳脂分離機(jī)脫脂乳（乳脂含量<0.5%水牛乳質(zhì)量）→HCl調(diào)pH值至4.6→沉淀酪蛋白→過(guò)濾，棄濾液→酪蛋白加少量蒸餾水清洗多次至上清液無(wú)色→用0.05 mol/L的NaOH溶液在一定溫度下溶解酪蛋白→完全溶解后→加蒸餾水調(diào)至實(shí)驗(yàn)所需酪蛋白底物濃度，并調(diào)pH值至酶解所需條件→取水牛乳酪蛋白溶液→加適量酶→在一定條件下進(jìn)行酶解→反應(yīng)中持續(xù)滴加0.5 mol/L的NaOH溶液維持反應(yīng)體系pH值，并記錄水解液所需堿液體積，計(jì)算水解度→水解完成后沸水中5 min使酶失活→快速冷卻至室溫→調(diào)節(jié)溶液pH值至4.6，4 200 r/min離心，去除未被水解的酪蛋白→取上清液，調(diào)節(jié)pH值至6.8，冷凍干燥→得到多肽。

表1 DPPH自由基清除率測(cè)定加樣方法

1.2.5 各蛋白酶的最適反應(yīng)條件

根據(jù)酶生產(chǎn)廠家提供的酶的最適反應(yīng)pH值、時(shí)間以及溫度條件，測(cè)定酶解底物的水解度及DPPH自由基清除率，選擇最優(yōu)的蛋白酶。各酶的水解條件如表2所示。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)均測(cè)定3 次，取平均值。

2 結(jié)果分析

2.1 蛋白酶的選擇

圖1 水解度的測(cè)定結(jié)果

不同蛋白酶對(duì)同一種蛋白質(zhì)底物作用的酶切位點(diǎn)不一致，蛋白質(zhì)水解物中多肽的分子鏈長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)、含量、組成、活性不同[5]。在制備抗氧化肽中常用的蛋白酶中選擇木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶、中性蛋白酶、動(dòng)物復(fù)合蛋白酶、植物復(fù)合蛋白酶、Protamex蛋白酶作為實(shí)驗(yàn)用酶。由于各酶種類、來(lái)源差別很大，蛋白酶的活力在運(yùn)輸、保存過(guò)程中會(huì)發(fā)生變化，因此必須按照國(guó)際單位重新測(cè)定蛋白酶的活力，以規(guī)范酶活力單位。各種蛋白酶活力的測(cè)定結(jié)果如表3所示。根據(jù)酶活力來(lái)確定各種蛋白酶的加入量。

2.2 不同蛋白酶酶解過(guò)程中水解度的測(cè)定

不同蛋白酶對(duì)水牛乳蛋白的水解度如圖1所示。在0～1 h，隨著酶解時(shí)間的增加，各種酶酶解酪蛋白的水解度急劇增大；1 h后，隨著水解的進(jìn)行，由于可作用底物減少、肽鍵切割位點(diǎn)減少、蛋白酶部分失活以及產(chǎn)物積累對(duì)酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制，水解度增加變緩。同等條件下達(dá)到穩(wěn)定水解度時(shí)，各種酶的水解度大小為：堿性蛋白酶＞動(dòng)物復(fù)合蛋白酶＞中性蛋白酶＞諾維信Protamex蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞植物復(fù)合蛋白酶。

表2 6 種酶的酶解條件

2.3 不同蛋白酶酶解物DPPH清除率的測(cè)定

對(duì)不同蛋白酶的酶解產(chǎn)物進(jìn)行DPPH清除率測(cè)定，結(jié)果如圖2所示：濃度為30 mg/mL的各酶解產(chǎn)物DPPH清除率大小為：堿性蛋白酶＞植物復(fù)合蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞諾維信Protamex蛋白酶＞動(dòng)物復(fù)合蛋白酶。

堿性蛋白酶對(duì)水牛乳蛋白的水解能力以及酶解物DPPH自由基清除能力最強(qiáng)，分別為24.30%以及66.63%。且堿性蛋白酶價(jià)格低廉，性價(jià)比高，最終選擇堿性蛋白酶作為水牛乳的酶解蛋白酶。

表3 蛋白酶活力的測(cè)定結(jié)果

圖2 酶解物DPPH自由基清除率

3 結(jié)論

以水牛乳為原料，采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、動(dòng)物復(fù)合蛋白酶、諾維信復(fù)合蛋白酶、植物復(fù)合蛋白酶對(duì)水牛乳蛋白進(jìn)行酶解實(shí)驗(yàn)，其中，采用堿性蛋白酶酶解水牛乳蛋白其水解度及酶解底物的DPPH自由基清除率最高，分別達(dá)到24.30%以及66.63%，最終選擇堿性蛋白酶為水牛乳蛋白的水解蛋白酶。

[1]鄒遠(yuǎn)東.蛋白質(zhì)的酶法降解揭開(kāi)了生命科學(xué)新的一頁(yè).當(dāng)代經(jīng)濟(jì)，2005（4）：40-41.

[2]Mirquez M C，F(xiàn)erundez V.pH-stat method to evaluate the heat inactivation of subtilis inhibitor in legumes.Chem Biochem Eng Q，2002，16（1）：31-35.

[3]Ting Sun，Chi T H.Antioxidant activities of buckwheat extracts.Food Chemistry，2005（90）：743-749.

[4]Saiga A，Tanabe S，Nishimura T.Antioxidant activity of peptides obtained from porcine myofibrillar proteins by protease treatment.Journal of Agricultural and Food Chemistr，2003（51）：3661-3667.

[5]王璋.食品酶學(xué).北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，1994.