福州地區漢族群體15個STR基因座遺傳多態性研究

紀鳳卿 藤 菁 賴 力 韓麗麗 沈曉麗▲

1.福建省廈門市中醫院檢驗科，福建廈門 351009；2.福建省立醫院司法鑒定所，福建福州 351004

短串聯重復序列（short tandem repeat，STR）又稱微衛星DNA（micro satellite DNA），是一種廣泛存在于人類基因組中可遺傳、不穩定、且具高度多態性的DNA序列[1]。目前人類基因組內已發現了七千個以上的STR位點，平均每15kb就存在一個STR基因座。由于STR核心單位重復數目的變化，構成了STR基因座的遺傳多態性。STR基因座因其分布廣泛、信息量大，基因片段短、擴增效率高、易于檢測，判型準確，且具有高度多態性并遵循孟德爾共顯性遺傳等諸多優點，已廣泛應用于遺傳連鎖分析、腫瘤等疾病相關基因的定位、器官移植、人類遺傳學、法醫學親權鑒定及個體識別、身源認定等研究領域。由于STR 的基因頻率和基因型的分布在不同地區之間存在差異，法醫學應用價值及特點都有所不同，因此，各實驗室利用STR 遺傳標記開展群體遺傳學研究及法醫鑒定工作[2]，國內外許多DNA 實驗室致力于DNA 檢測基因座的群體遺傳學研究[3-6]，以尋找到適合于不同民族、不同群體個人識別和親權鑒定的基因座。本研究對350例福建福州地區漢族無關個體的15個STR基因座遺傳多態性進行調查，并對其應用進行評估。

1 材料與方法

1.1 樣本

取來自福建省立醫院司法鑒定所2012年3月～2013年1月的日常檢案，總共350例無關個體，均來自福州五區八縣地區漢族人群。

1.2 DNA提取

采用chelex-100快速提取法從血樣中提取DNA，經DNA濃度測定符合標準后-20℃保存。

1.3 試劑

AmpFlmSTR IdentifilerTM 試劑盒（ABI，美國）。

1.4 PCR擴增

PCR反應在Eppendorf Master Gradient型PCR擴增儀上進行，反應體系和條件嚴格按說明書進行操作。

1.5 毛細管電泳

將PCR擴增產物與DNA分子量標準550及去離子甲酰胺（HIDI）混勻，95℃變性 3min，立即冷卻到 4℃，在Applied Biosystems 3130遺傳分析儀上進行毛細管電泳。

1.6 熒光檢測分型

用基因掃描軟件（Date collection）檢測擴增片段的熒光標記，以LIZ-550等為內標，根據擴增的STR片段大小確定STR基因座，以等位基因梯階（Ladder）為標準，用基因分型軟件（Genemapper ID v3.1）確定15個常染色體STR基因座的等位基因型。

1.7 統計學處理

運用PowerMarker V3. 1軟件及Modified-powerstate 軟件記錄無關個體的基因型，對15個STR 基因座進行Hardy-Weinberg平衡檢驗，計算各STR 基因座等位基因數目及基因型數目、等位基因頻率、雜合度觀察值Ho、個人識別DP、非父排除概率 PE、多態信息含量PIC 以及該15個基因座的累計個人識別率TDP、累計非父排除概率 CPE。

2 結果

350份福州地區漢族無關個體15個STR基因座的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05），具體見表1。350例福州地區漢族無關個體發現的稀有等位基因情況見表2。檢測的15個STR遺傳標記均具有高度多態性，除基因座TPOX外，其他基因座雜合度均超過0.60， 匹配概率 0.032～0.225，個體識別力 0.775～0.968， 多態性信息含量0.55～0.86，非父排除率0.285～0.761，具體見表3。

表1 福州地區漢族群體15個STR基因座等位基因頻率

表2 福州地區漢族群體15個STR基因座的各項法醫遺傳學參數

表3 福州地區350個無關個體發現的稀有等位基因情況

3 討論

3.1 應用STR 基因座作為親子鑒定的優點

STR 基因座在人類基因組中分布廣泛，基因片段長度差異較小，容易擴增，各基因座的擴增條件相似，沒有優先擴增的問題，適用復合擴增，簡化程序，分型規范，自動化程度高，效率高[7]。本研究對15個STR基因座進行基因分型，其重復單位在3～5bp，因此分型結果穩定，可重復性好，符合理想STR基因座的條件。

3.2 IdentifilerTM體系15個STR基因座在福州漢族人群中的法醫學應用評估

這15個STR基因座在福州地區漢族人群中基因頻率分布均勻，表現出高度多態性，分布符合Hardy-Weinberg平衡定律。Gin等[8]認為DP≥0.9，H≥0.7的基因座具有高鑒別力。按此標準，本研究選擇的10個基因座 D8S1179、D13S317、D19S433、D18S51、D21S11、D16S539、vWA、D5S818、D2S1338、FGA屬于高鑒定力、高雜合度的基因座。這15個STR基因座具有較高法醫學個人識別和親子鑒定運用價值。通常情況下檢測這些試劑盒的STR 基因座已能夠基本滿足法醫物證中個體識別和三聯體親子鑒定的檢測要求。但是在一些二聯體和出現了突變可能的三聯體案件中，需要增加檢測更多的STR 基因座。有關方面的研究進展還待于學者們進一步的探索。一方面STR 基因座具有高度多態性， 另一方面，STR 的突變率也很高[9-10]。故2010年由司法部制訂出臺的親權鑒定技術規范中對常染色體STR基因座的選擇有明確的要求[11]：（1）經過群體遺傳學調查，多態性高，非父排除率在0.7以上。（2）經過500次以上減數分裂的家系調查，基因座的突變率在0.002以下。按此標準，IdentifilerTM體系15個STR基因座在福州漢族人群中的非父排除率只有D18S51、FGA兩個基因座滿足0.7以上，其余13個基因座并沒達到此標準。同類的現象在本地區曾健等[12]學者的研究中也見報道。本研究認為可能是IdentifilerTM體系的15個STR基因座主要是針對歐美群體而設計的，并非完全符合福州地區人群個體識別和體親子鑒定的檢測要求。為此學者必須進一步尋求更符合該地區鑒定要求的新的STR基因座。

3.3 福州漢族人群中所發現罕見等位基因的應用價值

當大量群體進行STR分型時，往往會發現一些新的等位基因。由于這些等位基因在等位基因階梯中沒有對應大小的片段，通常需要自己去定義，在實踐中稱這些等位基因[13]為“off-ladder（OL）”等位基因，即罕見等位基因。本研究所發現稀有等位基因均在美國國家標準和技術研究所（NIST）STRBase網站上公布的各種常用STR基因座的“offladder ”等位基因范圍內。其類型有兩種[14]：一是超出該基因座ladder范圍的罕見等位基因（第一類型）；二是出現在兩個等位基因之間的罕見等位基因（第二類型）。國內學者徐志成等[15]用IdentifilerTM系統對罕見等位基因及其頻率的研究提出，IdentifilerTM檢測系統中，ladder主要以歐美等西方人群遺傳背景為基礎制備，而 STR基因座的核心序列，在不同種族的人群中分布差異較大，因此該體系并不完全適用于中國人群的基因檢測。這些罕見等位基因的出現，給檢測結果判讀帶來一定的困難。而本研究也認為罕見等位基因的存在及其確定，有助于提高各STR基因座的個體識別能力、非父排除率等。同時也提示各試劑生產公司應制備更加完善的、 適合中國人群的 ladder以分析這些數據。尤其在試劑國產化的過程中更加要注重這方面數據的收集，并將這些數據放在ladder中，使DNA個體識別和親權鑒定的試劑更加符合中國人群。當然，若要發現更多稀有等位基因，無疑需要進一步擴大群體數量。

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