健脾養胃方對人胃腺癌SGC7901細胞株的生長抑制和誘導凋亡作用的實驗研究

舒 鵬貢婷潔（.江蘇省中醫院，江蘇南京009；.無錫市中醫醫院，江蘇無錫400）

胃癌是世界范圍內最常見的惡性腫瘤，其發病率和死亡率均居于各種惡性腫瘤的前位[1-2]，對人類的生命和健康造成極大的威脅。我國是胃癌的高發區，預計今后若干年內胃癌的發病率還將持續上升，其防治是當前醫學研究的重點和難點，也是我國對重大疾病防治工作的重點領域。化療是胃癌的重要治療手段，然而新藥、新方案的出現并未能使其有效率顯著提高，中醫藥作為腫瘤綜合治療的手段之一被臨床廣泛應用。目前普遍認為中醫藥在預防腫瘤，增強患者的免疫功能，對放化療的解毒增效，抗復發轉移及延長患者的生存期，改善生活質量等方面均有其獨特作用。多年來，大量臨床研究結果表明，以健脾養胃方為基礎的中醫藥治療可以降低胃癌術后復發轉移[3]，本實驗擬對其作用機理進行進一步探討。

1 實驗材料

人胃腺癌SGC7901細胞，由江蘇省中醫院腫瘤科實驗室提供。RPMI1640培養基購自GIBCO公司，新生牛血清購自杭州四季清生物技術有限公司，胰酶蛋白粉、PBS粉、MTT（四甲基偶氮唑鹽）購自Sigma公司，二甲基亞砜（DMSO）購自上海凌峰公司。Matrigel膠、AnnexinV-FITC凋亡試劑盒購自美國BD公司。

2 實驗方法

2.1 健脾養胃方的制備健脾養胃方由生、炙黃芪，黨參，茯苓，炒白術，當歸，白芍，陳皮，半夏，三棱，莪術，石見穿，白花蛇舌草，炒谷麥芽，焦楂曲，炙甘草組成。制備方法：將藥物加入10倍量水，浸泡1h，加熱2h，回收藥液，藥渣中加入之前一半量的水，再次煎煮2h后，回收藥液。合并2次藥液，過濾并濃縮至所需濃度，4℃冰箱保存備用 。以上藥液由江蘇省中醫院制劑部提供。

2.2 實驗分組實驗組：臨用前將中藥加入RPMI1640培養液，濃度分別為2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL。空白組：不加任何藥物。西藥組：加入5-Fu。

2.3 實驗步驟

2.3.1 酶聯免疫檢測藥物對人胃腺癌SGC7901細胞增殖作用的影響[6-7]在含10%小牛血清的RPMI 1640培養液中常規培養細胞，在細胞達到指數增長期時開展實驗。消化細胞，離心，收集細胞，接種于96孔板，置37℃、5%CO2溫箱培養48h，使其貼壁生長。吸棄培養液，加入含有不同濃度藥物的RPMI1640培養液200μL，繼續培養48h。傾倒培養液，PBS洗2次，每孔加入200μL含10%小牛血清RPMI1640+20μLMTT培養液，繼續培養4h。吸掉上清，每孔加入150μLDMSO，置搖床上低速振蕩10min，使結晶物充分溶解。在酶聯免疫檢測儀490nm處測量各孔的吸光值。重復3次。

抑制率＝（1－實驗組OD值/對照組OD值）×100%

2.3.2 藥物對人胃腺癌SGC7901細胞侵襲力的影響[8-9]按上述方法培養細胞，接種于10cm培養皿中，置37℃、5%CO2溫箱培養24h，使其貼壁生長。加入含有不同濃度藥物的RPMI1640培養液，繼續培養48h。在濾膜的上下表面分別鋪以5μgmatrigel，超凈工作臺中過夜干燥。使用前水化基底膜，將transwell小室放入培養板中。各實驗組細胞饑餓處理，重懸于含無血清的培養基中。上室按1×106/mL密度加入200μL細胞懸液，下室加入300μL含10%小牛血清的RPMI1640培養液+300μL趨化因子，常規培養。24h后取出濾[4-5]膜，棉簽擦去濾膜上層細胞，移去小室，倒置，風干；濾膜底部加50μL含0.1%結晶紫，風干，PBS清洗；將膜取下，直徑上取5個視野，照相，計數。按以下公式計算細胞的侵襲抑制率：

細胞侵襲抑制率=（1-實驗組侵襲細胞數/空白組侵襲細胞數）×100%

2.3.3 流式細胞儀檢測藥物對人胃腺癌SGC7901細胞凋亡的影響[10-11]按上述方法培養細胞，接種于細胞培養皿。繼續培養細胞，使細胞貼壁，培養至細胞基本覆蓋培養皿底部。傾倒培養液，加入含有不同藥物的RPMI1640培養液，繼續培養于 37℃、5%CO2溫箱。培養48h后，收集細胞培養液，收集所有細胞。加入300μL 1X Binding Buffer緩沖液重懸細胞，將細胞轉移至流式管中，加入5μL的FITC Annexin V、5μL 的PI，在避光處輕輕搖晃培養管，孵育細胞15min，25℃。用流式細胞儀檢測。

2.3.4 流式細胞儀檢測藥物對人胃腺癌SGC7901細胞周期的影響[12-13]接種細胞，使細胞貼壁，培養至細胞基本覆蓋培養皿底部。傾倒培養液，加入含有不同藥物的RPMI1640培養液，繼續培養于37℃、5%CO2溫箱。培養48h后，收集細胞培養液，用PBS洗細胞2次，消化，收集所有細胞。離心，再用PBS洗細胞2次，吸棄PBS。加入75%乙醇，于4℃固定4h

以上。1500r/min離心5min，棄上清，以3mL的PBS洗滌1次，加入400μL溴化乙錠（PI，50μg/mL），100μL RNase A（100μg/mL），4℃避光孵育30min。用流式細胞儀檢測。

3 實驗結果

3.1 藥物對人胃腺癌SGC7901細胞增殖作用的影響結果見表1。健脾養胃方作用SGC7901細胞48h后，對細胞增殖有顯著的抑制作用。高劑量組藥物的抑制率可達88.06%，中劑量組的抑制率為56.70%，低劑量組的抑制率為34.24%。經t檢驗，與空白組比較，差異均有統計學意義（P＜0.005）。

3.2 藥物對人胃腺癌SGC7901細胞侵襲力的影響結果見表2。各組藥物作用SGC7901細胞24h后侵襲細胞數均低于空白組 （P＜0.001）。空白組細胞輪廓清晰、活力旺盛，各藥物組細胞變圓、稀疏，且呈現劑量相關性（見圖1）。

3.3 藥物對人胃腺癌SGC7901細胞凋亡的影響見表3、圖2。健脾養胃方高劑量、中劑量組細胞凋亡數明顯高于空白組，并呈濃度依賴性，表現出明顯的量效關系（P＜0.01）。

3.4 流式細胞儀檢測健脾養胃方對人胃腺癌SGC7901細胞周期的影響 結果見表4、圖3。不同濃度健脾養胃方作用48h，可以影響SGC-7901細胞周期分布，使G2/M期比例增

表1 各組藥物作用48h后SGC7901細胞增殖抑制率

表2 藥物作用24h后各組侵襲細胞數

圖1 藥物作用24h后各組SGC7901細胞侵襲力 注：A.空白組；B.健脾養胃方低劑量組；C.健脾養胃方中劑量組；D.健脾養胃方高劑量組

表3 藥物對人胃腺癌SGC7901細胞凋亡的影響

高，與空白組比較差異顯著（P＜0.05）。在健脾養胃方濃度達4mg/mL時，G2/M期細胞比例增至17.64%，在G1峰前可見明顯凋亡峰。濃度為6mg/mL中藥組細胞死亡較多，結果無意義。

4 討論

中醫學認為，胃癌的發生與六淫、飲食、七情有關，脾胃虛弱是其基本病機，虛、痰、瘀、毒是其主要病理機制。我省名中醫劉沈林教授總結多年臨床經驗，根據胃癌脾胃虛弱這一主要病機，提出以健脾養胃為主的治療原則，并創健脾養胃方，在臨床上治療胃癌患者，特別是中晚期胃癌患者，取得了較好的臨床療效。該方由炙黃芪、黨參、炒白術、當歸、白芍、莪術、石見穿、炙甘草等中藥組成。方中炙黃芪為補脾益氣之要藥，黨參、白術、甘草取四君子湯之意，益氣健脾；莪術、石見穿活血行氣消積。全方有健脾養胃、活血化瘀之功，正合胃癌脾胃虛弱之主要病機。多年來，我們運用該方治療進展期胃癌并進行了大量的臨床研究，結果顯示其可以較好地緩解消化道腫瘤患者，特別是胃癌患者的臨床癥狀，恢復體力，增加體重，提高免疫功能，減輕其他治療的毒副反應，降低復發轉移，提高生活質量，延長生存期。

本實驗以人胃腺癌SGC7901細胞為載體，開展了健脾養胃方對胃癌細胞生長抑制和誘導凋亡作用的研究。實驗結果顯示：健脾養胃方有抑制人胃腺癌SGC7901細胞增殖的作用，高劑量組對細胞的增殖抑制率最高，達到88.06%；運用健脾養胃方作用細胞24h后，侵襲的細胞數明顯減少；該方作用細胞48h后可以誘導腫瘤細胞凋亡，還可誘導腫瘤細胞G2/M期周期阻滯。這一研究結果為健脾養胃方治療胃癌提供了可靠的實驗依據。

在此基礎上，我們還將對該方的信號轉導通路行進一步的實驗研究，以從分子層面深入探討其作用機制，為中藥復方治療腫瘤提供新的理論依據。

表4 健脾養胃方對人胃腺癌SGC7901細胞周期的影響

圖3 健脾養胃方對人胃腺癌SGC7901細胞周期的影響 注：A.空白組；B.1mg/mL健脾養胃方組；C.2mg/mL健脾養胃方組；D.4mg/mL健脾養胃方組

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