肢體反復短暫缺血預處理在大鼠腦缺血再灌注損傷中的保護作用

張曉敏，李光來

腦血管病是現(xiàn)實生活中危害人類生命健康的常見病和多發(fā)病，以其高發(fā)病率、高復發(fā)率、高致殘率、高死亡率受到醫(yī)學界的廣泛關注。在腦血管病的治療中，肢體反復短暫缺血預處理（LEP）在腦保護方面的研究是近年研究的熱點之一，但對于其具體機制仍不十分明確和完善，因此進一步探討肢體反復短暫缺血預處理在腦缺血再灌注損傷中的保護作用尤為重要。本課題通過觀察肢體反復短暫缺血預處理時對大鼠腦缺血及缺血再灌注腦組織超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）及三磷酸腺苷（ATP）酶水平的影響，探討其對腦缺血再灌注損傷的保護作用，為腦缺血患者的臨床治療提供一條安全、無創(chuàng)、有效的新途徑，達到及時指導、早期治療、提高患者生存率和生存質(zhì)量的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 在山西醫(yī)科大學實驗動物中心選取成年健康雄性Wistar大鼠42只，鼠齡3個月～4個月，體重200g～250g。

1.1.2 實驗分組 42只 Wistar大鼠，隨機分為假手術(shù)組（A

組）、腦缺血組（B組）、腦缺血再灌注組（C組）、LIP組（D組）。LIP組再分為4組：LIP 0h組（D1組）、LIP 6h組（D2組）、LIP 12h組（D3組）、LIP 24h組（D4組），分別在LIP后即刻、6h、12h、24h行腦缺血再灌注。每組各6例。

1.1.3 實驗設備 721分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；TGL－16G高速冷凍離心機（上海安亭科學儀器廠）；電熱恒溫水浴鍋（上海醫(yī)療器械廠）；XW－80A漩渦混合器（上海手術(shù)器械廠）；醫(yī)用低溫冰箱（日本三洋公司）；電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械廠）；JY98－ⅢN超聲波破碎儀（上海京工實業(yè)有限公司）；光學顯微鏡（日本OLYMPUS公司）。

1.1.4 主要試劑 微量MDA測定試劑盒、SOD測定試劑盒、超微量ATP酶試劑盒、考馬斯亮藍蛋白含量試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。普通試劑由山西醫(yī)科大學實驗中心提供。721分光光度計，其他試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1 大鼠大腦中動脈局灶性腦缺血再灌注模型的制備 采用改良Longa法［1］建立大鼠右側(cè)大腦中動脈缺血再灌注模型。將大鼠用10%水合氯醛3mL／kg腹腔麻醉，頸正中右旁開0.5 cm～1cm切口，鈍性分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈、頸總動脈近心端，在頸總動脈距離分岔口大約5 cm處用眼科剪剪開一小口，將直徑0.236mm的進口魚線插入，以分岔口處開始測量距離，插入1.8cm～2cm后固定魚線，縫合。缺血2h后將線栓拉出1cm左右即可，形成再灌注。其中假手術(shù)組插入1.0cm魚線。神經(jīng)功能缺損評分按照Longa等［1］的5級4分法標準。

1.2.2 肢體反復短暫缺血預處理方法 大鼠仰臥固定，根據(jù)氣壓式肢體循環(huán)促進儀構(gòu)造［2］自制小型充氣氣囊設備，在雙側(cè)股動脈處充氣10min夾閉股動脈造成肢體缺血，松氣再灌注10 min，反復4次。

1.2.3 神經(jīng)功能缺陷評分標準 采用Longa等的5級4分法。0分：無神經(jīng)功能缺損癥狀；1分：輕度局灶性神經(jīng)功能缺損，即提尾不能伸展左側(cè)前爪；2分：中度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走向左側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：重度局灶性神經(jīng)功能缺損，即行走困難，并向左側(cè)傾倒；4分：不能自發(fā)行走，意識水平下降。

1.2.4 實驗注意事項 實驗過程中的動物飼養(yǎng)及取材均遵守實驗動物管理和保護的有關規(guī)定。實驗過程中，適當用白熾燈照射動物，維持其肛溫在37℃左右，直到恢復活動，室溫保持20℃以上，除去未出現(xiàn)相應腦缺血體征或缺血后出現(xiàn)癲癇及生命體征不平穩(wěn)的大鼠。

1.2.5 腦組織病理切片的制備及MDA、SOD、ATP含量的測定 各組大鼠缺血2h再灌注24h后行神經(jīng)功能評分后頸椎脫臼處死，在冰盤上快速取腦，置0℃～4℃生理鹽水中漂洗，除去血液，濾紙拭干，各組隨機取1只大鼠右側(cè)腦組織迅速固定，石蠟包埋后，在海馬部位做矢狀切片，厚約5μm，HE染色，觀察腦組織變化。剩余右側(cè)腦組織加入9倍量的0℃～4℃生理鹽水，在冰水浴中用玻璃勻漿器制成10%的腦勻漿，3 000r／min離心15min，取上清液檢測MDA、SOD、ATP。嚴格按照試劑盒說明書步驟要求操作，計算出各項指標含量。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)，定量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，各組間定量資料的比較采用單因素方差分析，P＜0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 光鏡下腦組織HE染色結(jié)果 A組大腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)細胞形態(tài)基本正常。B組、C組神經(jīng)細胞變性壞死明顯，胞體腫脹，周圍間隙增寬，結(jié)構(gòu)不清，出現(xiàn)不同程度的核深染、核固縮、核溶解。D組神經(jīng)細胞呈輕度缺血改變，變性壞死不明顯，胞體呈輕度腫脹，神經(jīng)細胞缺失較B組、C組輕。

2.2 各組腦組織SOD活力、MDA含量比較 各組中SOD活力的比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），B組、C組、D組的SOD值均低于A組。D1組、D2組與B組和C組比較差異有統(tǒng)計學意義，且SOD值均高于B組，推測預處理初期有效。D3組、D4組與D1組、D2組比較差異有統(tǒng)計學意義。各組中MDA含量的比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），B組、C組、D組的MDA值均高于A組。D1組、D2組、D3組、D4組與B組及C組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且MDA值均低于B組、C組，說明預處理后 MDA含量有所下降。D3組、D4組與D1組比較差異有統(tǒng)計學意義。詳見表1。

表1 各組中SOD活力與MDA含量的比較（±s）

表1 各組中SOD活力與MDA含量的比較（±s）

MDA含量nmol／mgp組別 n SOD活力U／mgprot rot 6 135.08±4.21 1.55±0.38 B組 6 96.65±4.121） 3.98±0.211）C組 6 98.19±4.761） 3.13±0.611）2）D1組 6 121.94±8.331）2）3） 1.95±0.472）3）D2組 6 116.67±10.341）2）3） 2.34±0.471）2）3）D3組6 103.83±5.661）4）5） 2.62±0.381）2）3）4）D4組6 101.66±3.201）4）5） 2.53±0.451）2）3）4）與A組比較，1）P＜0.05；與B組比較，2）P＜0.05；與C組比較，3）P＜0.05；與D1組比較，4）P＜0.05；與D2組比較，5）P＜0.05 A組

2.3 各組腦組織 ATP含量比較 各組中 Na＋－K＋－ATP，Ca2＋－Mg2＋－ATP含量的比較差異均有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且B組、C組、D3組、D4組 Na＋－K＋－ATP含量均低于 A組（P＜0.05）。D1組、D2組、D3組、D4組 Na＋－K＋－ATP含量均高于 B組與 C組（P＜0.05）；D1組、D2組 Ca2＋－Mg2＋－ATP含 量 均 高 于 B 組 （P＜0.05）。D3 組、D4組 Na＋－K＋－ATP，Ca2＋－Mg2＋－ATP含 量 低 于D 1組 、D 2組 （P＜0.05）。各組中總ATP含量的比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），且ATP含量均低于A組。D1組、D2組總ATP含量高于B組（P＜0.05）。D1組總ATP含量高于C組（P＜0.05）。D3組、D4組總ATP含量均低于D1組（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組中ATP含量比較（±s）

表2 各組中ATP含量比較（±s）

組別 n Na＋－K＋－ATP Ca2＋－Mg2＋－ATP 總6 8.09±0.99 5.56±0.67 21.15±2.27 B組 6 2.89±0.651） 1.94±0.571） 15.54±2.071）C組 6 4.08±0.731）2） 2.37±0.561） 16.57±2.641）D1組 6 7.77±1.002）3） 4.80±0.741）2）3） 20.67±2.162）3）D2組 6 7.37±0.782）3） 4.79±0.541）2）3） 18.26±2.521）2）D3組 6 6.39±0.851）2）3）4）5）2.76±0.421）2）4）5） 17.74±1.711）4）D4組 6 5.37±0.691）2）3）4）5）2.32±0.461）4）5） 17.33±1.311）4）與A組比較，1）P＜0.05；與B組比較，2）P＜0.05；與C組比較，3）P＜0.05；與D1組比較，4）P＜0.05；與D2組比較，5）P＜0.05 ATP A組

3 討 論

近年來對肢體反復短暫缺血預處理在腦缺血再灌注損傷中的保護作用方面的研究較多，但對于其具體作用機制方面的研究較少。本課題通過觀察大鼠肢體反復短暫缺血預處理時腦組織SOD、MDA及ATP酶水平的影響，探討其在腦缺血及缺血再灌損傷中可能的保護作用，以指導臨床中腦缺血患者的治療，提高患者的生存率，減少復發(fā)率及致殘率，提高患者的生存質(zhì)量。

本實驗通過LIP后對大鼠腦組織MDA、SOD含量及ATP酶活性變化進行統(tǒng)計學分析，觀察LIP在大鼠腦缺血再灌注損傷中的保護作用，結(jié)果顯示大鼠腦缺血再灌注時大腦出現(xiàn)明顯損傷性改變，經(jīng)過股動脈反復4次短暫（10min）夾閉的LIP可使1d內(nèi)腦缺血引起的神經(jīng)元損傷有所改善，即通過觀察肢體反復短暫缺血再灌注0h、6h、12h、24h大鼠腦組織 MDA、SOD、ATP的變化情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)反復短暫肢體缺血再灌注后大鼠腦組織中 MDA、ATP早期即有明顯的升高，12h、24h升高不明顯。這些結(jié)果表明LIP可以對遠隔器官腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生對抗作用，但間隔時間過長，LIP的這種保護作用有所減弱。這與Lepore等［3］研究發(fā)現(xiàn)大鼠后肢損傷性缺血前1d給予缺血預處理不能改善肌肉的生存狀況，認為LIP對后續(xù)的肢體缺血再灌注損傷不能產(chǎn)生延遲性保護作用結(jié)果相一致。分析其相關機制可能為：①腦缺血后血流重建時缺血區(qū)自由基增多，與不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化連鎖反應［4］，分解產(chǎn)生MDA，使腦組織生物膜結(jié)構(gòu)破壞、蛋白降解、核酸主鏈斷裂、透明質(zhì)酸解聚、細胞崩解，腦細胞發(fā)生不可逆性損害，導致神經(jīng)元死亡。②SOD作為體內(nèi)清除自由基的首要物質(zhì)，通過清除超氧陰離子自由基保護神經(jīng)細胞免受損傷。③腦缺血再灌注早期，腦細胞內(nèi)ATP合成減少，依賴ATP的離子泵，尤其是Na＋－K＋－ATPase功能減弱，使大量Na＋內(nèi)流，K＋外流，細胞膜電位下降產(chǎn)生去極化，從而引起突觸前膜釋放興奮性氨基酸，興奮性氨基酸主要通過受體活化方式而起興奮性介質(zhì)作用，受體活化效應主要引發(fā)大量的Ca2＋內(nèi)流，同時激活細胞內(nèi)Ca2＋庫的釋放，導致細胞內(nèi)游離Ca2＋超載，激活了各種降解酶，引起DNA、蛋白質(zhì)和磷脂降解，細胞代謝、結(jié)構(gòu)與功能多方面的異常改變，神經(jīng)細胞逐步死亡。有文獻表明，細胞內(nèi)Na＋增多，導致滲透壓升高，是再灌注早期腦細胞內(nèi)水腫和神經(jīng)細胞壞死的重要原因［5］。同時過量Ca2＋沉積于線粒體，使線粒體氧化磷酸化失偶聯(lián)進一步加重，膜電位喪失，導致細胞能量的嚴重丟失，同時致使O2經(jīng)單電子還原生成超氧陰離子（O2－）增多，產(chǎn)生的大量自由基引起膜脂質(zhì)過氧化，導致膜結(jié)構(gòu)破壞，線粒體功能障礙，細胞膜通透性也增加，發(fā)生細胞溶解和組織水腫等一系列損害作用。此外有學者研究發(fā)現(xiàn)，LIP能明顯對抗后續(xù)即刻給予的損傷性腦缺血再灌注引起的大鼠海馬CA1區(qū)延遲性神經(jīng)元死亡，并從LIP后NO動態(tài)變化、C－Fos、Hsp蛋白的表達，神經(jīng)途徑闡釋了LIP對腦缺血再灌注損傷保護作用的可能機制［6－8］。

反復短暫肢體缺血預處理是一種便捷、安全、有效的腦保護方法，對腦缺血再灌注損傷有保護作用，其機制可能與增加自由基清除酶SOD活性，抑制脂質(zhì)過氧化反應，降低MDA含量有關。通過促進腦缺血再灌注后線粒體脂肪酸代謝，提高糖代謝，加速ATP產(chǎn)生，及早恢復缺血半暗區(qū)能量供應，阻斷后續(xù)的鏈式神經(jīng)元損傷反應，產(chǎn)生神經(jīng)細胞保護作用有關。Na＋－K＋－ATPase活性升高可糾正細胞內(nèi)酸中毒，Ca2＋－Mg2＋－ATPase活性升高可糾正Ca2＋超載，反復短暫肢體缺血預處理通過提高腦缺血再灌注后 Na＋－K＋－ATPase和Ca2＋－Mg2＋－ATPase活性，維持鈉泵、鈣泵的穩(wěn)定，使細胞內(nèi)外Na＋、Ca2＋平衡，從而穩(wěn)定神經(jīng)細胞膜電位，起到神經(jīng)細胞保護作用。

雖然本實驗將預處理組區(qū)分了四個時間點，但LIP對缺血再灌腦保護的具體時間窗有待進一步研究，在以后的試驗中需更詳細的制定時間窗以及對其他相關機制進一步研究。

［1］Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middle cerebral artery occulusion without craniectomy in rats［J］.Stroke，1989，20：84－91.

［2］趙玉璽.氣壓式肢體血液循環(huán)促進儀的設計［J］.液壓與汽動，2006（2）：31.

［3］Lepore DA，Morrison WA.Ischemic preconditioning：Lack of delayed protection against skeletal muscle ischemia reperfusion［J］.Microsurgery，2000，20（7）：350－355.

［4］王銳，李光來，成學恭.通竅健腦膠囊對大鼠腦缺血再灌注損傷后SOD、MDA及線粒體酶的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2005，3（3）：234－236.

［5］張三妹，李光來.阿米洛利對大鼠腦缺血再灌注損傷后ATP酶的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，6（2）：186－188.

［6］趙紅崗，李玉潔，李文斌，等.肢體反復短暫缺血再灌注后腦組織一氧化氮的動態(tài)變化［J］.中國臨床康復，2005，9（9）：67－70.

［7］趙紅崗，李文斌，孫曉彩.神經(jīng)途徑在肢體缺血預處理抗腦缺血／再灌注損傷中的作用［J］.中國應用生理學雜志，2007，23（1）：19－25.

［8］Zhan HG，Li WB，Li QJ，et al.Limb ischemic preconditioning attenuates apoptosis of pyramidal neurons in the CA1hippocampus induced by cerebral ischemia－reperfusion in rats［J］.Acta Physiologica Sinica，2004，56（3）：407－412.