氣相色譜-質(zhì)譜法測定飼料中三聚氰胺

四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心 楊曉鳳 梁 立 毛建菲

三聚氰胺，俗稱蛋白精，是一種三嗪類含氮雜環(huán)有機(jī)化合物，由于其分子中含氮原子比較多，可在奶質(zhì)品檢測中造成蛋白質(zhì)含量達(dá)標(biāo)的假象。目前，三聚氰胺的檢測方法主要有高效液相色譜法（張靜等，2011）、液相色譜-質(zhì)譜法 （蔡勤仁等，2008）、氣相色譜-質(zhì)譜法（賈濤，2010）等。 本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜-質(zhì)譜法中SIM模式對飼料中三聚氰胺進(jìn)行測定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 島津GC-MS 2010 Plus，配有MSD檢測器；HR-XC陽離子交換固相萃取小柱60 mg/3 mL（振翔產(chǎn)品）；氮?dú)獯祾邇x；Agilent固相萃取裝置；離心機(jī)；渦旋混合器；具塞塑料離心管；0.45 μm有機(jī)微孔濾膜。

1.1.2 試劑 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品（德國DrEhrenstorferGmbH公司）；甲醇（色譜純）；三氯乙酸（分析純）；乙酸鉛（分析純）；氨水（分析純）；衍生化試劑：N，O-雙三甲基硅基三氟乙酰胺 （BSTFA）+三甲基氯硅烷（TMCS）（V∶V=99∶1）（迪馬公司）；超純水。

1.1.3 溶液的配制 20%甲醇溶液：量取甲醇200 mL，加入超純水800 mL，混勻。

1%三氯乙酸溶液：稱取三氯乙酸10 g，加水溶解并定容至1000 mL。

22 g/L乙酸鉛溶液：稱取乙酸鉛22 g，用水溶解后定容至1000 mL。

5%氨化甲醇溶液：量取氨水5 mL，用甲醇定容至100 mL容量瓶中。

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：準(zhǔn)確稱取100.0 mg三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)品于100 mL棕色容量瓶中，用甲醇水（20%，V∶V）溶液溶解并定容至刻度，配制成濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于4℃避光保存。

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)中間液：吸取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液5.0 mL，用甲醇溶液定容至50 mL棕色容量瓶中，該溶液濃度為100.0 mg/L，于4℃冰箱內(nèi)貯存。

三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液：取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)液適量，分別用甲醇稀釋成 0.01、0.02、0.05、0.10、0.20、0.50、2.00、4.00 mg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液 （使用時(shí)現(xiàn)配）。

1.2 方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 提取 準(zhǔn)確稱取飼料樣品2 g（精確至0.001 g）于50 mL具塞離心管中，準(zhǔn)確加入18 mL三氯乙酸溶液，渦旋30 s，超聲提取20 min，再加入2 mL乙酸鉛溶液，渦旋30 s，4000 r/min離心5 min，取上清液待凈化。

1.2.1.2 凈化 活化及平衡：按順序加入3 mL甲醇，3 mL水；上樣：加入5 mL上清提取液；淋洗：按順序加入3 mL水，3 mL甲醇，棄去淋洗液，并將小柱抽干；洗脫：加入6 mL 5%的氨化甲醇洗脫，收集洗脫液于10 mL比色管中；濃縮：將洗脫液在50℃的條件下用氮?dú)獯蹈伞?/p>

1.2.1.3 衍生化 將已吹干的比色管內(nèi)加入1.0 mL吡啶，渦旋1 min，再加入200 μL衍生化試劑，渦旋30 s，蓋好塞子，放入70℃的培養(yǎng)箱內(nèi)衍生反應(yīng)30 min；準(zhǔn)確移取三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)工作液1.0 mL于10 mL比色管中，氮?dú)獯蹈珊笞鐾窖苌Ｑ苌磻?yīng)完成后，將溶液冷卻至室溫，過0.45 μm濾膜，上機(jī)。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：DB-5MS柱 （30 m×0.25 mm × 0.25 μm）；載氣：氦氣，流速 1.0 mL/min；進(jìn)樣量：1 μL；進(jìn)樣方式：不分流，1 min后分流比為25；進(jìn)樣口溫度：250℃；程序升溫：起始溫度70℃，保持1 min，以20℃/min升至300℃，保持5 min；傳輸線溫度：300℃；掃描范圍：50～500 m/z；掃描模式：選擇離子掃描，監(jiān)測離子99、171、327、342 m/z；離子源溫度：230 ℃；EI源轟擊能：70 eV。

1.2.3 測定 定性方法：試樣與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間的相對偏差不大于0.5%，特征離子豐度與標(biāo)準(zhǔn)品相差不大于20%。定量方法：以327為定量離子，342、171和99為輔助定性離子，標(biāo)準(zhǔn)曲線定量。

2 結(jié)果與討論

2.1 檢測方法的選擇 實(shí)驗(yàn)首先采用高效液相色譜法的Agilent ZORBAX 300-SCX強(qiáng)陽離子交換色譜柱（4.6 mm × 150 mm，5 μm）對飼料中三聚氰胺進(jìn)行測定，結(jié)果見圖1。由圖1可見，三聚氰胺色譜峰的附近存在干擾峰，而氣相色譜-質(zhì)譜法可通過選擇離子監(jiān)測模式（SIM）有效去除干擾雜質(zhì)峰，測定結(jié)果見圖2。由圖2可見，氣相色譜-質(zhì)譜法測定三聚氰胺無干擾，故本實(shí)驗(yàn)采用氣相色譜-質(zhì)譜法對三聚氰胺進(jìn)行測定。

2.2 固相萃取柱的選擇 因?yàn)槿矍璋肥菈A性化合物，所以應(yīng)采用陽離子固相萃取柱凈化。本實(shí)驗(yàn)比較了MCX固相萃取柱和HR-XC固相萃取柱的凈化效果。應(yīng)用這兩種類型的SPE小柱對添加了2 mg/kg三聚氰胺的空白飼料樣品進(jìn)行了測試，測定結(jié)果分別為1.854 mg/kg和1.847 mg/kg。說明兩種SPE柱均能有效地去除飼料樣品中的雜質(zhì)，使三聚氰胺的色譜峰不受干擾。但應(yīng)用HRXC固相萃取柱凈化后色素偏淺，對氣相色譜-質(zhì)譜的進(jìn)樣口及進(jìn)樣襯管保護(hù)效果更好，因此，本實(shí)驗(yàn)樣品測定采用HR-XC固相萃取柱對飼料樣品進(jìn)行凈化。

2.3 線性范圍及檢出限 將三聚氰胺系列標(biāo)準(zhǔn)溶液按1.2.2中色譜條件作GC-MS分析，以質(zhì)量濃度（C）和峰面積（A）作線性回歸，得到線性方程為 A=2593046×C-38471.6，相關(guān)系數(shù) r=0.9996。 說明三聚氰胺在0.01～4.00 mg/L線性關(guān)系良好。

在本實(shí)驗(yàn)條件下，將一定量三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到空白樣品中，經(jīng)提取、凈化后測定，根據(jù)信噪比（S/N）=3的峰響應(yīng)值和樣品前處理的稀釋倍數(shù)，得出方法的檢出限為0.01 mg/kg。

2.4 方法的精密度和回收率 為考察方法的準(zhǔn)確度和精密度，對空白飼料進(jìn)行了加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，采用3個(gè)不同水平的添加量，每個(gè)水平平行測定6份，回收率測定結(jié)果見表1。由表1可見，平均回收率為90.2% ～94.8%，RSD為1.3% ～4.0%，方法準(zhǔn)確度和精密度良好。

表1 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

[1]蔡勤仁，歐陽穎瑜，錢振杰，等.超高效液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中殘留的三聚氰胺[J].色譜，2008，26（3）：339 ～ 342.

[2]賈濤.氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法檢測飼料中三聚氫胺的探討[J].飼料廣角，2010，1：33 ～ 35.

[3]張靜，李云，趙立軍，等.高效液相色譜法測定畜禽組織中的三聚氰胺[J].檢驗(yàn)檢疫學(xué)刊，2011，21（3）：20 ～ 22.