基于復合EST-SSR標記的大白菜種子純度鑒定及SNP位點獲取

趙 新 王 永* 蘭青闊 賀長征 陳 銳 李歐靜 劉 娜朱 珠 郭永澤

（1天津市農業質量標準與檢測技術研究所，天津 300381；2天津市種子管理站，天津 300061）

大白菜〔Brassica campestrisL. ssp.pekinensis（Lour）Olsson〕為十字花科蕓薹屬蔬菜，作為我國主要的蔬菜作物在農業生產中占有重要位置。大白菜的種植區域分布廣泛，種植數量較多，近幾年對大白菜種子純度的監督抽查工作較為重視，種子質量的好壞直接影響到種子生產者、經營者和使用者的合法權益。因此，加強大白菜種子純度的控制和檢查管理尤為重要。傳統的田間形態鑒定是種子純度鑒定的仲裁方法，但時間長、易受環境條件的影響，因此為適應種子純度快速鑒定的需求，室內分子檢測技術成為近年來研究的熱點。

隨著分子生物學標記技術的發展，人們開始利用分子標記技術進行種子純度的研究，ESTSSR技術是其中的一種。EST-SSR技術又叫基于表達序列標簽（expressed sequence tags，EST）的簡單重復序列（si mple sequence repeats，SSR）標記技術，與其他分子標記技術相比具有技術操作簡單、特異性較強、重復性穩定、多態信息含量高、共顯性遺傳等特點（Powell et al.，1996；忻雅 等，2006）。同時GenBank數據庫中積累了大量重要物種的EST序列，且獲取方便，無需任何費用，已經成為發展SSR標記的重要來源，因此EST-SSR技術不僅保留了SSR標記技術的優點，而且凸顯了其便捷、花費低、效率高的優勢（Wim et al.，2009）；但SSR技術也存在著相對的不足，即一次試驗得到的位點較少，針對這一問題，Tommasini等（2002）發展了多重SSR分析技術，并有效地鑒定了油菜品種。

EST-SNP技術也叫基于表達序列標簽的單核苷酸多態性（Single Nucleotide Polymorphism，SNP）標記，是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性，是繼SSR之后的新一代分子標記技術，具有密度高、穩定性好、分析易自動化等特性，近年來被廣泛應用于甜瓜、菜豆、甜椒等蔬菜分子輔助育種及品種鑒定研究（Carlos et al.，2009；Wim et al.，2009；Jung et al.，2010；蘭青闊 等，2012）。

本試驗以10份大白菜雜交種及其親本為試材，利用新型復合EST-SSR分子標記進行大白菜雜交種純度鑒定的研究，篩選雜交種特異譜帶為親本互補帶型的引物，建立一次試驗可獲得多位點的標記方法，快速、高通量、低成本，確保了種子純度鑒定結果的可靠性。同時基于EST序列信息，結合HRM和Pyrosequencing技術，初步探索了大白菜SNP位點的篩選、確認和檢測技術路線，旨在為建立精確、快速、高通量和高度自動化的大白菜種子純度鑒定方法提供技術參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2011年12月至2012年11月在天津市農業質量標準與檢測技術研究所遺傳育種分析實驗室進行，以10份市售大白菜雜交種（表1）為試驗材料，種子由天津科潤蔬菜研究所提供。

1.2 方法

1.2.1 單粒種子育苗條件 本試驗通過1臺簡單的恒溫培養箱來模擬種子萌發外界條件，達到在最短時間內成功育苗的效果，以提高試驗效率。具體方法如下：采用玻璃培養皿，以棉花、紗布墊底，用自來水將其濕潤后均勻撒入單粒種子，為持久保持種子濕潤度，在種子表面再覆蓋一層面巾紙，夜間在28 ℃恒溫培養箱中過夜，白天采用室溫日光燈補光，48 h種子破殼率可達100%，7 d后發芽率可達100%。

表1 供試品種名稱及特征特性

1.2.2 DNA提取 選取經48 h剛剛破殼的大白菜種子和經7 d達到苗期的單株葉片，同時應用改良CTAB法進行DNA提取，經1%凝膠電泳檢測，比較DNA提取質量。具體改良CTAB法如下：取單粒破殼種子或單株葉片粉碎，加入CTAB-A液（裂解緩沖液）550 μL，65 ℃水浴30 min；加入氯仿異戊醇500 μL，顛倒混勻，13 200 r·min-1離心10 min；吸取上清液500 μL，加入2倍體積CTAB-B液（沉淀緩沖液），室溫靜置30 min；13 200 r·min-1離心10 min；棄上清液，沉淀中加入350 μL CTAB-C液，回溶；加入350 μL氯仿異戊醇，顛倒混勻，13 200 r·min-1離心10 min；吸取上清液340 μL，加入0.7倍體積預冷的異戊醇，顛倒混勻，13 200 r·min-1離心10 min；棄上清液，沉淀中加入500 μL 70%乙醇清洗，13 200 r·min-1離心10 min；棄上清液，沉淀風干，加入30～40 μL TE緩沖液充分溶解后即為DNA。

1.2.3 高通量快速DNA提取方法 為適應大批量種子純度鑒定工作的需要，對種子高通量快速DN A提取方法進行比對，包括chexe-100法、堿煮法、CTAB-A液直接裂解法。3種方法都分別設置20、40、60、120 min 4個時間梯度，具體方法如下：① chexe-100法。使用電動組織研磨器將單粒種子或單株葉片破壁打碎至粉漿狀，加入50 μL chexe-100，65℃水浴，設置時間梯度；-20℃冷凍10 min，13 200 r·min-1離心3～4 min，上清液即為DNA。② 堿煮法。使用電動組織研磨器將單粒種子或單株葉片破壁打碎至粉漿狀，加入50 μL NaOH（1 mol·L-1），100 ℃煮沸，設置時間梯度；加入 25 μL Tris-HCl（1 mol·L-1，pH 8.0），100 ℃煮沸 5 min；-20℃冷凍10 min，13 200 r·min-1離心3～4 min，上清液即為DNA。③ CTAB-A液直接裂解法。使用電動組織研磨器將單粒種子或單株葉片破壁打碎至粉漿狀，加入50 μL CTAB-A液，65 ℃水浴，設置時間梯度；-20 ℃冷凍10 min，13 200 r·min-1離心3～4 min，上清液即為DNA。

1.2.4 EST-SSR引物設計與合成 利用GenBank（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/sites/entrez）上公布的170 148條大白菜EST序列，通過CMD SSR Server（http：//www.cottonmarker.org/cgibin/cmd_ssr）在線設計30對核心引物，命名為BC1～BC30，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。

1.2.5 復合EST-SSR引物篩選 以大白菜雜交種及其親本的基因組DNA為模板，分別用30對EST-SSR引物進行擴增，產物用8%聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測。 篩選出雜交種特異譜帶為親本互補帶型的引物，同時結合單一引物擴增結果及特異譜帶的相互位置差異，優化組合多個引物對，篩選復合EST-SSR標記。

1.2.6 PCR擴增體系及程序 PCR擴增反應的總體積為10 μL：2×GoTaq?Master Mixes 5 μL，上游和下游引物（10 μmol·L-1）各0.25 μL，大白菜基因組DNA模板（50 ng·μL-1）1 μL，雙蒸水補足10 μL。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min； 94 ℃變性1 min，53.5 ℃退火45 s，72℃延伸45 s，35個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

1.2.7 EST-SNP位點獲取 基于兩種技術路線探索EST-SNP獲取方法。方法一：分析ESTSSR引物聚丙烯凝膠電泳結果，回收親本互補條帶并測序，經序列比對尋找SNP候選位點，設計引物，通過焦磷酸驗證，確定Baicai-9 SNP位點。方法二：通過NCBI數據庫查詢蕓薹屬SNP位點，設計PCR引物，對大白菜雜交種及其親本進行擴增，通過高分辨率溶解曲線分析候選SNP位點，擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，應用生物學軟件對序列進行Blast比對，對候選13 799 SNP位點設計焦磷酸引物進行驗證。

2 結果與分析

2.1 單粒種子育苗條件及提取狀態確定

從圖1和圖2可以看出，從48 h破殼的大白菜種子和經7 d達苗期狀態的大白菜單株提取的基因組DNA均表現主帶清晰，整齊一致，沒有明顯降解，可用于下一步PCR擴增。

圖1 48 h破殼的大白菜基因組DNA電泳結果

圖2 經7 d達苗期的大白菜基因組DNA電泳結果

2.2 引物及復合EST-SSR引物篩選結果

以10份大白菜雜交種及其親本為模板，對30對EST-SSR引物進行篩選，其中7對引物的雜交種帶型為雙親的互補帶型，可用于大白菜雜交種種子純度的鑒定。選取其中條帶清晰、特異性主帶位置差異明顯的3對引物，用于鑒定種子純度。對這3對引物進行優化組合，確定了一套復合EST-SSR引物，可同時對10份大白菜雜交種進行種子純度鑒定。引物序列及可鑒定品種見表2。應用這套復合EST-SSR引物對10份大白菜雜交種進行純度鑒定的聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜如圖3所示。由表2和圖3均可得出雜交種1（秋綠75）、3（秋綠60）、5（津白56）可同時應用3對引物對其純度進行鑒定，既提高了鑒定效率，也增強了純度鑒定結果的可靠性。

表2 引物序列及可鑒定品種名稱

2.3 高通量快速DNA提取方法比較結果

3種高通量快速DNA提取方法提取大白菜津白56經48 h破殼狀態的單粒種子和經7 d達到苗期狀態的單株葉片基因組DNA，經1%瓊脂糖電泳均未見DNA條帶，但以chexe-100法提取經7 d達到苗期狀態的單株葉片的DNA為模板，經PCR擴增可達到EST-SSR理想的鑒定效果，其他2種方法提取的DNA均未擴增出相應條帶，結果如圖4所示。且3種方法所需單株狀態均為苗期，可見種子破殼初期的狀態尚難以滿足高通量快速DNA提取的需要。

圖3 10份大白菜雜交種復合EST-SSR引物純度鑒定結果

2.4 Baicai-9 SNP位點獲取

2.4.1 SNP候選位點的獲得 應用引物BC-9擴增雙親，以回收的特征譜帶DNA為模板進行PCR擴增，產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，拼接測序結果，對雙親特異性條帶的序列進行比對，通過堿基差異尋找SNP候選位點，結果如圖5所示。

2.4.2 SNP引物設計與合成 應用焦磷酸引物設計軟件，對SNP候選位點進行引物設計，引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。引物序列見表3。

圖4 不同提取方法提取津白56 DNA的復合EST-SSR引物擴增結果

圖5 引物BC-9擴增大白菜親本序列同源性比對結果

2.4.3 SNP位點的驗證 通過焦磷酸測序引物（正向和反向引物）對秋綠75、秋綠60、耐抽薹型春綠1號、津白56、秋綠55、津夏3號的親本及雜交種進行前期PCR擴增。PCR擴增反應的總體積為50 μL：2×GoTaq?Master Mixes 25 μL，上游和下游引物（10 μmol·L-1）各1.25 μL，基因組DNA模板（50 ng·μL-1）3 μL，雙蒸水補足 50 μL。PCR反應程序為：94℃預變性5 min；94 ℃變性1 min，53.5 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 45 s，40個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

測序單鏈的制備：將3 μL鏈親和素包被的磁珠和47 μL binding buffer混勻，然后加入到50 μL的PCR產物中，1 300～1 400 r·min-1室溫下振蕩混勻10～15 min；預先在PSQ Low反應板中加入40 μL含有0.3 μmol·L-1測序引物的Annealing Buffer；在Vacuum prep workstation中進行單鏈制備，備用。再根據軟件提示，在試劑艙相對應位置加入所需的底物，酶和A、C、G、T。焦磷酸測序反應堿基噴入次序（dispensation order）為C/TAGCTCTGGGA。由C-T堿基峰高與后續AGCTC堿基峰高比較可以看出，SNP分型為C/T，篩選得到的SNP位點可對6份大白菜雜交種進行純度鑒定，測序結果如圖6所示。

表3 SNP引物序列

圖6 6種大白菜雜交種SNP鑒定結果

2.5 13 799 SNP位點獲取

通過NCBI數據庫查詢蕓薹屬SNP位點，設計PCR引物，對大白菜雜交種及其親本進行擴增，擴增產物送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，應用生物學軟件對序列進行Blast比對，對候選位點設計SNP焦磷酸引物，進行驗證，通過津夏3號驗證13 799是否為SNP位點，能否用于雜交種純度鑒定。

2.5.1 依據蕓薹屬SNP位點設計PCR引物 通過查詢CuGenDB數據庫，獲得Contig 13 799序列信息，該序列在94 bp 處具有C/T/A多態性的候選SNP位點、在96 bp 處具有C/T/G多態性的候選SNP位點、在107 處具有C/T/G多態性的候選SNP位點。使用LightScanner Primer Design software設計用于高分辨率熔解曲線技術掃描分析（HRM）的PCR引物，上游引物序列為 H13799-F：5′-TTACTTTCGCCGACACAAAC -3′，下游引物序列為 H13799-R：5′- ATGTGCTCCTATGTAACCCA-3′。

2.5.2 測序及SNP引物設計 依據HRM掃描分析結果，將候選SNP位點送上海生工生物工程技術服務有限公司測序，依據Contig 13 799序列信息，使用PSQ Assay Design軟件設計一套焦磷酸測序引物，包括PCR上游引物P13799-F：Biotin-5′-CAACCATTGCTGATTAGAGTAACA-3′、下 游 引 物 P13799-R：5′-TTGATTTAGCGTTAGGGAGTCTG -3 ′ 及 測 序 引 物 P13799-Seq：5′-GCTAGTGAGACCGTTAAGAT-3′。

2.5.3 焦磷酸測序結果 依據HRM掃描分析結果，對候選SNP位點進行PCR擴增和焦磷酸測序確認。焦磷酸測序反應堿基噴入次序（dispensation order）為GC/TCTAGC，其中第1位堿基G和第5位堿基A為陰性對照。圖7為焦磷酸測序結果，由C、T堿基峰高與后續CTAGC堿基峰高比較可以看出，SNP分型為C/T，命名該SNP位點為13 799。該位點與采用2.4中回收雙親特征譜帶測序的技術路線，所獲取的津夏3號SNP位點實為大白菜品種的同一SNP分子特異性標記位點。

圖7 津夏3號SNP鑒定結果

3 結論與討論

隨著基因組數據庫的不斷完善以及分子輔助育種技術的突破性進展，使得種子真實性鑒定及純度檢測的田間形態學標記正逐步被分子標記技術所替代。與傳統形態學性狀鑒定相比，基于DNA水平差異的EST-SSR標記技術，具有穩定性高、共顯性、重復性好等特點，而且開發成本相對低廉（趙新 等，2013），更重要的是其檢測不受基因表達和環境條件的影響，可以在植株生長的任何階段進行，大大提高了檢測效率，可以在育種初期及時有效地保證育種的質量，避免造成不必要的經濟損失。

近年來，通過不斷研究大白菜基因組序列信息和SSR位點特異性分子標記，豐富了相關數據信息，但SNP位點特異性分子標記長期以來未見研究報道，在一定程度上滯后了分子標記等現代育種手段在大白菜育種和種子純度鑒定上的應用（魯忠富 等，2012）。本試驗基于EST序列信息，通過兩種技術路線，成功獲取到大白菜品種同一SNP分子特異性標記位點，更加確保了位點的可靠性，同時應用獲取EST-SNP位點的方法和思路，結合分子生物學基礎信息研究，通過進一步的測序、篩選，可以獲取更多的EST-SNP特異性位點，對更多的大白菜品種或其他物種進行標記和鑒定，為分子輔助遺傳育種課題組下一步工作奠定了基礎。

然而，對于種子純度鑒定，無論是田間形態學還是分子標記技術，其純度結果與檢樣量基數密切相關，為確保檢測結果的準確性，必須保證充足且科學的檢樣量基數，一般一個品種的檢測數量不得少于60株單株。因此，為適應高通量種子純度檢測的需要，本試驗對EST-SSR標記復合體系進行了篩選，根據單一引物的相互位置差異進行優化組合，使單一引物的擴增片段處在不同片段大小的區域，避免復合標記結果的重疊性，同時對提高檢測效率的相關環節也進行了優化。復合EST-SSR標記對10份大白菜雜交種純度鑒定具有很好的區分效果，通過一次反應最多可同時檢測到3個不同的多態性標記位點，既有效地降低了試驗成本，同時又加大了試驗結果的可靠性。通過對提高檢測效率的相關環節的摸索，確定了最佳育苗條件及DNA提取方法，對于高通量苗期單株DNA的提取可在40 min內完成，在一定程度上有效地節省了檢測時間，降低了人力物力的消耗。

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