通天草提取物對AD大鼠行為學的影響

賈博宇，姜 波，李寶龍，劉 旭，周忠光

(黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 150040)

隨著人類壽命的延長，與年齡相關性疾病的發病率也顯著增加，而以腦疾病增加最為顯著［1］，其中最典型的代表疾病即為阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)，即人們常說的“老年性癡呆”。AD是以記憶力減退、認知功能障礙為特征的神經退行性疾病。臨床上表現為學習記憶能力下降、分析判斷能力減退、情緒改變及行為失常，嚴重者可出現意識模糊。目前對這類疾病的治療仍具挑戰性，使患者及其家人感到恐慌，AD不僅嚴重影響老年人的日常生活和社會活動能力，還常常剝奪人類的精神活動功能，其病情隨時間呈進行性加重，在幾年內便可喪失獨立生活能力。老年癡呆已經成為現代社會的一個危機，被人們形象地稱為“時間炸彈”。

通天草又名地栗梗，《飲片新參》中稱之為荸薺梗，在《蘇州本產藥材》中稱為荸薺苗，還有一種叫法為野荸薺苗。為莎草科(Cyperaceae)植物荸薺 Heleocharis dulcis(Burm.f.)Trin.ex Henschel的地上莖部分。本品性味苦、平，有化濕熱，利小便，通淋的作用，主要用來治療“呃逆”和“小便不利”等癥。本課題組經研究發現通天草提取物對老年性癡呆具有一定的防治作用。本研究采用醇提法和水提法，分別從通天草里提取相關可溶性物質，分組給藥一段時間后，觀察AD大鼠模型Morris水迷宮行為學的影響，從而為開發治療阿爾茨海默癥的新藥提供新的數據支持和理論基礎。

1 通天草提取物的制備

本研究所用通天草提取物，均在黑龍江中醫藥大學藥物安全性評價中心試驗室利用“醇提法”和“水提法”自行提取得到。

1.1 試驗藥材來源及鑒定

1.1.1 試驗藥材來源

通天草:為莎草科(Cyperaceae)植物荸薺Heleocharis dulcis(Burm.f.)Trin.ex Henschel的干燥地上莖部分。產地江蘇。

1.1.2 鑒定依據及結果

試驗所用全部藥材均購自于哈爾濱市藥材公司，按照1989年江蘇地方標準有關通天草的各項規定檢查，鑒定結果均符合規定。

1.2 試驗儀器設備

RE-52系列旋轉蒸發儀(上海亞榮生化儀器廠);HHS型電熱恒溫水浴鍋(上海博迅實業有限公司);101-0AB型電熱恒溫鼓風干燥箱(天津市泰斯特儀器有限公司);FA2004型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司);HY-02型粉碎機(北京環亞天元機械技術有限公司);KQ-160TDB型高頻數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);DETW型調溫電熱套(北京市永光明醫療儀器廠);SHZ-IIIB型循環水真空泵(沈陽海普瑞真空設備有限公司)。

1.3 試驗試劑

無水乙醇(分析純，天津天力化學試劑廠)

1.4 提取方法

1.4.1 醇提取物

精密稱取通天草400g，加10倍量(4 000mL)的80%乙醇浸泡1.5h至飽和，加熱回流提取2次，每次回流1.5h，過濾，殘渣晾干待用，合并兩次濾液，分批裝入旋轉蒸發儀40℃ ～50℃減壓回收，乙醇待用，合并殘留藥液水浴90℃蒸干后放入干燥箱，60℃干燥得到醇提取物質干膏，打粉待用。

1.4.2 水提取物

上一過程中過濾得到的藥材殘渣，加10倍量(4 000mL)的蒸餾水加熱回流提取2次，每次1.5h，過濾，合并兩次濾液，加熱濃縮至500mL，水浴90℃蒸干，放入干燥箱60℃干燥得到水提取物質干膏，打粉待用。

1.5 出膏率測定

試驗共計提取通天草原藥材7 013.1g。醇提法:得干膏417g，1g藥粉含原藥材 17.1469g;水提法:得干膏451.2g，1g 藥粉含原藥材 15.6229g。

2 通天草提取物對AD大鼠行為學影響的試驗研究

2.1 試驗動物

選擇4～5月齡清潔級Wistar雄性大鼠，體重220g±20g，由黑龍江中醫藥大學試驗動物中心提供，動物許可證號:SCXK黑2008004。

2.2 試驗儀器設備

Morris水迷宮(中國醫學科學院藥物研究所);SN-2大鼠腦立體定位儀(日本);10ul微量進樣器(寧波市鎮海玻璃儀器廠);52-97型自動三重純水蒸餾器(上海亞榮生化儀器廠)。

2.3 試驗試劑及藥品

Aβ1-40(Sigma公司);水合氯醛(昆山);0.9%生理鹽水(哈藥集團制藥六廠);吡拉西坦片(又名腦復康片，東北制藥廠生產，國藥準字H21021775，產品批號101250;配制成含生藥0.0432g/mL水溶液，4℃保存);通天草提取物(醇低 組 0.04724g/mL;醇 高 組 0.189g/mL;水 低 組(0.05185g/mL;水高組 0.2074g/mL)。

2.4 試驗過程

2.4.1 動物篩選

大鼠在屏障系統內飼養觀察7d后，進行Morris水迷宮測試，篩選智力正常(潛伏期≤60S)并且游泳姿勢正常的Wistar大鼠用于本次試驗。

2.4.2 動物分組

隨機選取96只經水迷宮篩選合格大鼠，隨機分為空白組、假手術組、模型組、醇提低劑量組、醇提高劑量組、水提低劑量組、水提高劑量組和西藥對照組，每組各12只。

2.4.3 模型復制

用0.9%無菌生理鹽水將Aβ1-40稀釋成濃度為5g/L的溶液，將稀釋液放置于37℃恒溫箱中7d，使Aβ1-40形成聚集肽，然后取出放入-20℃冰箱中備用。

手術器械及手術臺先用紫外線照射再用75%酒精和碘伏消毒，大鼠造模前24h禁食，腹腔注射10%水合氯醛(3mL/kg)麻醉。將大鼠的頭部水平固定于腦立體定位儀上，去除手術區毛發并做常規消毒，然后沿矢狀線切開皮膚，切口長約2cm，向兩側推開皮膚和骨膜，找到“前囟”位置［2，3］。并經預試驗確定顱骨上能夠到達大鼠海馬Ca1區位置的注射點及進針深度(前囟后3.5mm，中線向左旁開2mm，進針3.5mm)，用9號鋼針自制的鉆頭在注射點打孔，微量注射器自顱骨硬模下垂直進針3.5mm，然后在5min內向腦組織內緩慢勻速注射 Aβ1-40溶液2uL(10μg)，注射完成后留針5min，然后緩慢退針，用牙科泥封住顱骨孔，手術區撒少量青霉素消炎，縫合皮膚并用碘伏消毒，假手術組用等體積0.9%生理鹽水代替Aβ1-40溶液，空白組不作任何處理，手術后大鼠單籠飼養至完全清醒。

2.4.4 給藥劑量及療程

各組大鼠造模完成后第7d開始，每日灌胃給藥1次:醇提高劑量組(1.89g/kg·d)，醇提低劑量組(0.47g/kg·d)，水提高劑量組(2.07g/kg·d)，水提低劑量組(0.52g/kg·d)，西藥組(0.43g/kg·d)，空白組、假手術組與模型組大鼠每日給予等容積0.9%無菌生理鹽水，各組療程都是28d。

2.4.5 行為學檢測

各組大鼠在造模后的第2d和給藥后第24d分別進行Morris水迷宮測試，測試方法同2.4.1，記錄大鼠潛伏期和60s內穿過原平臺位置的次數。

2.4.6 統計學分析

試驗數據組間比較使用SPSS16.0進行t檢驗，結果以±S表示。

3 試驗結果

造模后的各組AD大鼠在前4d的定位航行試驗中，游泳軌跡多表現為邊緣型或隨機型，空白組和假手術組部分大鼠在試驗的2～4d內能夠憑借空間記憶找到平臺，第5d的空間搜索試驗，各組AD大鼠的空間記憶能力明顯較空白組和假手術組大鼠差，入水后仍表現為隨機型，而空白組和假手術組大鼠多表現出直線型。各給藥組大鼠經過28d治療后，其學習記憶能力都有不同程度的改善，而模型組游泳軌跡仍表現出邊緣型和隨機型。

3.1 不同時期各組大鼠潛伏期的變化

造模前各組大鼠都經過Morris水迷宮篩選，其潛伏期無差別，術后第6d所做空間搜索試驗(結果見表1、圖1)，模型組大鼠潛伏期與正常組大鼠相比差異有顯著性意義(P＜0.01)，而假手術組大鼠潛伏期與正常組大鼠相比差異無意義(P＞0.05)，說明模型復制成功且穩定性良好。其余5個給藥組大鼠潛伏期與正常組大鼠比較，時間明顯延長，差異有顯著性意義(P＜0.01)，說明大鼠產生了認知功能障礙，可用于本試驗。

給藥治療后第28d，空間搜索試驗(結果見表1、圖1)顯示，模型組、醇提低劑量組、水提高劑量組和水提低劑量組與空白組比較具有顯著差異(P＜0.01)，潛伏期時間相對延長;醇提高劑量組、醇提低劑量組、水提高劑量組和西藥組與模型組比較具有顯著差異(P＜0.01)，潛伏期時間明顯縮短;水提低劑量組與模型組比較具有差異(P＜0.05)，潛伏期時間有所縮短，說明各組大鼠經過治療后，認知功能有所提高。

表1 治療前后各組大鼠Morris水迷宮試驗潛伏期的變化(±S)Tab.1 Test latency change before and after treatment the rats in Morris water maze(±S)

表1 治療前后各組大鼠Morris水迷宮試驗潛伏期的變化(±S)Tab.1 Test latency change before and after treatment the rats in Morris water maze(±S)

注:與空白組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;與模型組比較，ΔP ＜0.05，ΔΔP ＜0.01

組別 例數 劑量(g/kg) 造模后(s) 治療后(s)空白組 12 等體積 25.08±4.64 23.08±6.59ΔΔ假手術組 12 等體積 24.33±5.60 23.42±4.62ΔΔ模型組 12 等體積 44.75±6.51＊＊ 44.67±7.80＊＊醇提高劑量組 12 1.89 44.17 ±8.90＊＊ 25.92 ±8.36ΔΔ醇提低劑量組 12 0.47 46.75 ±5.12＊＊ 34.75 ±10.31＊＊ΔΔ水提高劑量組 12 2.07 47.08 ±7.82＊＊ 32.25 ±7.46＊＊ΔΔ水提低劑量組 12 0.52 44.33 ±8.66＊＊ 38.08 ±8.35＊＊Δ西藥組 12 0.43 45.00±6.24＊＊ 25.25±6.21ΔΔ

3.2 不同時期各組大鼠穿越平臺的次數

造模后第6d所做空間搜索試驗(結果見表2、圖2)，模型組、西藥組和通天草提取物4個給藥組與正常組比較，穿越平臺次數明顯減少，差異有顯著性意義(P＜0.01);而且假手術組大鼠與正常組大鼠比較差異無意義(P＞0.05)，證明模型復制成功且穩定性良好。

圖1 治療前后各組大鼠Morris水迷宮實驗潛伏期的變化Fig.1 Test latency change before and after treatment the rats in Morris water maze

給藥后第28d，空間搜索試驗(結果見表2、圖2)顯示，模型組與空白組比較有顯著差異(P＜0.01)，說明模型穩定;通天草提取物4個給藥組和西藥組與空白組比較無差異(P＞0.05);醇提高劑量組和西藥組與模型組比較具有顯著差異(P＜0.01)，穿越平臺次數明顯增加;醇提低劑量組、水提高劑量組與模型組比較具有差異(P＜0.05)，穿越平臺次數有所增加;水提低劑量組與模型組比較無差異(P＞0.05)，但穿越平臺次數也相對有所增加;說明各組大鼠治療后認知功能有所提高。

表2 治療前后各組大鼠穿越平臺的次數(x±S)Tab.2 The number of rats in each group through the platform before and after treatment(x±S)

4 討論

Morris水迷宮是英國心理學家Morris于1981年設計并應用于檢測大鼠空間學習記憶能力的一種常用裝置，已經成為一種研究空間學習和記憶能力的標準模式，被廣泛應用于與嚙齒類動物視覺相關的空間記憶和工作記憶的測量中。

通過對比不同時期各組大鼠潛伏期和穿越平臺的次數，可知造模后模型組和5個給藥組的大鼠潛伏期和穿越平臺的次數與正常組大鼠比較，時間明顯延長，次數明顯減少，差異有顯著性意義(P＜0.01)，說明試驗所需AD大鼠模型復制成功。治療后水迷宮試驗結果顯示，醇提低劑量組、水提高劑量組和水提低劑量組與空白組比較具有顯著差異(P＜0.01)，潛伏期時間相對延長;醇提高劑量組、醇提低劑量組、水提高劑量組和西藥組與模型組比較具有顯著差異(P＜0.01)，潛伏期時間明顯縮短;水提低劑量組與模型組比較具有差異(P＜0.05)，潛伏期時間有所縮短;說明醇提高劑量組、醇提低劑量組、水提高劑量組、水提低劑量組和西藥組對提高AD大鼠認知功能都具有一定效果，其中醇提高劑量組和西藥組作用效果最強，水提低劑量組療效最差。醇提高劑量組、醇提低劑量組、水提高劑量組、水提低劑量組和西藥組與空白組穿越平臺次數比較無差異(P＞0.05);醇提高劑量組和西藥組與模型組比較具有顯著差異(P＜0.01)，穿越平臺次數明顯增加，證實醇提高劑量組和西藥組療效最好，比較其潛伏期和穿越平臺次數，發現醇提高劑量組治療后潛伏期為25.92±8.36，穿越平臺次數為3.17±1.59，西藥組治療后潛伏期為25.25±6.21，穿越平臺次數為 3.25 ±1.49，說明西藥組的療效略好于醇提高劑量組;醇提低劑量組、水提高劑量組與模型組比較具有差異(P＜0.05)，水提低劑量組與模型組比較無差異(P＞0.05)，但穿越平臺次數都有所增加，說明這三組藥物也具有一定的治療效果，比較其潛伏期和穿越平臺次數，發現水提高劑量組治療后潛伏期為32.25±7.46，穿越平臺次數為2.92±1.38，醇提低劑量組治療后潛伏期為 34.75 ±10.31，穿越平臺次數為 2.83 ±1.40，水提低劑量組治療后潛伏期為38.08±8.35，穿越平臺次數為2.58±1.17，因此推測這三組通天草提取物的藥效:水提高劑量組＞醇提低劑量組＞水提低劑量。

圖2 治療前后各組大鼠穿越平臺的次數Fig.2 The number of rats in each group through the platform before and after treatment

研究結果表明:通天草提取物對AD大鼠的空間學習記憶能力具有一定程度的改善作用。

［1］楊東法.2010年度中國老齡事業發展統計公報［R］.北京:全國老齡辦，2011.

［2］包新民，舒斯云.大鼠腦立體定位圖譜(第1版)［M］.北京:人民衛生出版社.

［3］周忠光.補陽還五湯對Aβ1-40所致AD大鼠β-淀粉樣蛋白影響及相關機制的研究［D］.黑龍江中醫藥大學，2007:16-31.