金針菇深層發酵糖量測定

黨阿麗，陳立娟，王玉文，張恩波，杜世彧

(1.黑龍江省科學院微生物研究所，哈爾濱150010;2.黑龍江省科學院高技術研究院，哈爾濱150001)

在金針菇深層發酵過程中，應對其發酵液進行糖量檢查，以便有針對性地進行管理和控制。糖量化學分析測定方法有很多，如碘量法、3，5－二硝基水楊酸比色法、蒽酮比色法、斐林氏法等。其中，斐林氏法是生產實踐中常用的快速定糖方法。為此，筆者根據自己的試驗條件進行如下的糖量測定。

1 材料、儀器和試劑

(1)材料

測定樣液:我們從20株中篩選出的一個適于液體培養的金針菇菌株之深層發酵液。

(2)儀器

適宜的吸管、容量瓶、燒杯、三角燒瓶、滴定管等玻璃儀器;電爐、天平、離心機等。

(3)試劑

硫酸銅、次甲基藍、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、醋酸鉛、硫酸鈉等。

2 步驟和方法

2.1 試劑溶液的配制［1，2］

(1)斐林試劑:甲液，稱取15g硫酸銅(CuSO4·5H2O)和0.05g次甲基藍，用蒸餾水定容至1L。乙液，稱取50g酒石酸鉀鈉、54g氫氧化鈉和4g亞鐵氰化鉀，用蒸餾水定容至1L。

(2)0.1%標準葡萄糖溶液:準確稱取干燥恒重的葡萄糖1.00g，先用少量蒸餾水使之溶解，加8mL濃鹽酸以防微生物生長，再用蒸餾水定容至1L。

(3)10%醋酸鉛溶液:稱取10g醋酸鉛溶于100mL蒸餾水中即可。

(4)6N鹽酸:以等體積的蒸餾水稀釋試劑鹽酸。

(5)6N氫氧化鈉溶液:250g氫氧化鈉溶于1L蒸餾水中即可。

2.2 還原糖的測定

(1)樣品處理

除蛋白:將適量的金針菇發酵液于2 500rpm離心10min，取其上清液25mL，加入2.5mL10%醋酸鉛溶液，用蒸餾水定容至50mL，混勻。然后1 000rpm離心5min。

除剩余Pb2+:取上述除蛋白之上清液10mL于一小三角瓶內，加入0.5g硫酸鈉，振搖，離心之。棄去沉淀，再用蒸餾水使其上清液補足10mL，待測定。

(2)樣品測定

取經處理的樣液及其它試劑按表1加入三角瓶中。

表1 樣液和試劑加法及加量Tab.1 Reagents addition and addition dosage of the sample solution

按斐林氏熱滴定裝置測定［1］。

(3)計算

發酵液中還原糖含量的計算公式為:

Ve是樣液3次平行測定所耗用糖液總毫升數的平均值。

在該測定中，上式可簡化為:

2.3 總糖的測定

(1)樣品處理

量取15mL混勻的發酵液于一小玻璃容器中，加入適量的6N鹽酸，水浴加熱30min，再用6N氫氧化鈉中和酸，用蒸餾水稀釋至60mL，離心之。取其上清液25mL，加入12.5mL10%醋酸鉛溶液，其余操作與還原糖的測定相同。

(2)樣品測定

與還原糖的測定相同。

(3)計算

在該測定中發酵液中總糖含量的計算公式為:

3 結果和討論

3.1 試驗測定結果見表2［3］

3.2 討論

(1)本方法的關鍵是在保證試驗操作各項條件一致性情況下的快速滴定，即在沸騰狀態下3min之內將不到2.00mL的剩余糖液以4～5秒一滴的速度滴至終點。為此，應根據預測定試驗在未滴定之前預先加入V體積糖液。否則，滴定速度過慢，一方面會使反應液蒸發過多而改變溶液濃度等條件;另一方面，在接近滴定終點時，由于還原型的次甲基藍遇到空氣后又能轉為氧化型的次甲基藍而導致滴定終點判斷的錯誤，影響試驗結果的準確性。

表2 金針菇菌絲體發酵液分析測定結果Tab.2 Analysis results of Flammulina velutipes in fermented mycelium liquid

(2)滴定終點的判斷:肉眼觀察到藍色消失而出現黃色時即為滴定終點。

(3)通過對還原糖測定數據的分析，可知只要嚴格操作(包括各試劑的準確量取及其條件的一致)該法就有較高的精密度，這說明該法有很好的穩定性和重復性。但若要提高總糖測定的準確性，我們認為取樣是很重要的，必須從混合均勻的發酵液中取出具有代表性的樣液進行測定，結果才有意義。

(4)在測定之前，必須對樣品進行處理，因為如果不除去發酵液中的蛋白質，則在沸騰時會產生泡沫而帶起部分反應液，這樣在一定程度上就會影響反應正常進行。剩余鉛離子的存在也會影響滴定終點的判斷，從而導致錯誤結果。

(5)按上述公式計算所得的糖含量實際上指的是發酵液經離心除去其中的沉積物后之上清液的糖含量，如果說這可達到測定目的及滿足要求，則可將其視為發酵液的糖含量。但上清液的糖含量與發酵液的糖含量在數值和含意上是不同的，所以，從嚴格意義上講，計算發酵液中糖的百分含量時應將式中吸取測定樣品毫升數折算成相應的發酵液體積(毫升數)即可。

［1］朱儉.生物化學實驗［M］.上海:上海科學技術出版社，1981:4－8.

［2］洪震，卯曉嵐.食用藥用菌實驗技術及發酵生產［M］.北京:中國農業科技出版社，1992:233－236.

［3］杜世彧，黨阿麗，王鳳云.金針菇菌絲體的深層培養及多糖制取［J］.生物技術，1996，6(6):41 －44.